Summary
Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.
Abstract
Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, RNA işleme, sinyal iletimi, DNA hasar yanıtı, miRNA biyogenezi ve translasyon dahil olmak üzere çeşitli hücresel yolakların düzenlenmesinde rol oynayan yaygın bir protein post-translasyonel modifikasyonudur (PTM).
Son yıllarda, biyokimyasal ve analitik gelişmeler sayesinde, kütle spektrometresi (MS) bazlı proteomikler, hücresel metil-proteomu tek bölge çözünürlüğü ile karakterize etmek için en etkili strateji olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, MS tarafından in vivo protein R-metilasyonunun tanımlanması ve profillenmesi, esas olarak bu modifikasyonun substokiyometrik doğası ve çeşitli amino asit ikamelerinin varlığı ve metilasyona izobarik olan asidik kalıntıların kimyasal metil-esterifikasyonu nedeniyle zor ve hataya açık olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, R-metil-peptitlerin tanımlanmasını arttırmak için zenginleştirme yöntemleri ve metil-proteomik çalışmalarda Yanlış Keşif Oranlarını (FDR) azaltmak için ortogonal doğrulama stratejileri gereklidir.
Burada, hücresel örneklerden yüksek güvenilirliğe sahip R-metil-peptitlerin tanımlanması ve kantitasyonu için özel olarak tasarlanmış bir protokol tanımlanmıştır; bu, hücrelerin metabolik etiketlemesini, ağır izotop kodlu Metiyonin (hmSILAC) ve tüm hücre ekstraktının çift proteaz çözelti içi sindirimi ile birleştiren, ardından anti-pan-R-metil antikorları kullanılarak R-metil-peptitlerin çevrimdışı Yüksek pH Ters Faz (HpH-RP) kromatografi fraksiyonasyonu ve afinite zenginleştirmesi ile eşleştirilmiştir. Yüksek çözünürlüklü MS analizi üzerine, ham veriler önce MaxQuant yazılım paketi ile işlenir ve sonuçlar daha sonra MaxQuant çıktı dosyalarındaki hafif ve ağır metil-peptide karşılık gelen MS tepe çiftlerinin derinlemesine araştırılması için tasarlanmış bir yazılım olan hmSEEKER tarafından analiz edilir.
Introduction
Arginin ( R ) -metilasyon, memeli proteomunun yaklaşık% 1'ini süsleyen bir translasyonel modifikasyondur (PTM)1. Protein Arginin Metiltransferazlar (PRMT'ler), R'nin yan zincirinin guanidinos grubunun azot (N) atomlarına simetrik veya asimetrik bir şekilde bir veya iki metil grubunun birikmesiyle R-metilasyon reaksiyonunu katalize eden enzimlerdir. Memelilerde, PRMT'ler hem mono-metilasyon (MMA) hem de asimetrik di-metilasyon (ADMA), MMA ve simetrik di-metilasyon (SDMA) veya sadece MMA'yı biriktirme yeteneklerine bağlı olarak üç sınıfa ayrılabilir - sırasıyla 2,3. PRMT'ler esas olarak GAR motifleri olarak bilinen glisin ve arginin bakımından zengin bölgelerde bulunan R kalıntılarını hedef alır, ancak PRMT5 ve CARM1 gibi bazı PRMT'ler prolin-glisin-metiyonin bakımından zengin (PGM) motifleri metilleştirebilir4. R-metilasyon, RNA ekleme5, DNA onarımı6, miRNA biyogenezi7 ve çeviri2 gibi çeşitli biyolojik süreçlerin bir protein modülatörü olarak ortaya çıkmış ve bu PTM üzerindeki araştırmaları teşvik etmiştir.
Kütle Spektrometresi (MS), protein, peptit ve saha çözünürlüğünde küresel R-metilasyonunu sistematik olarak incelemek için en etkili teknoloji olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, bu PTM, MS tarafından yüksek güvenilirlikle tanımlanması için bazı özel önlemler gerektirir. İlk olarak, R-metilasyonu substokiyometriktir, peptitlerin değiştirilmemiş formu modifiye edilmiş olanlardan çok daha bol miktarda bulunur, böylece Veriye Bağımlı Edinme (DDA) modunda çalışan kütle spektrometreleri, yüksek yoğunluklu modifiye edilmemiş peptitleri, düşük yoğunluklu metillenmiş muadillerinden daha sık parçalayacaktır8. Ayrıca, R-metillenmiş saha tanımlaması için MS tabanlı iş akışlarının çoğu, biyoinformatik analiz düzeyinde sınırlamalardan muzdariptir. Gerçekten de, metil-peptitlerin hesaplamalı olarak tanımlanması yüksek Yanlış Keşif Oranlarına (FDR) eğilimlidir, çünkü bu PTM çeşitli amino asit ikamelerine (örneğin, glisin içine alanin) ve aspartat ve glutamatın metil-esterifikasyonu gibi kimyasal modifikasyonlara izobariktir9. Bu nedenle, Hücre kültüründe Amino Asitlerle Ağır Metil Kararlı İzotop Etiketleme (hmSILAC) gibi metil gruplarının izotop etiketlemesine dayanan yöntemler, in vivo metilasyonların güvenli MS-tanımlanması için ortogonal stratejiler olarak uygulanmış ve yanlış pozitif ek açıklamaların oranını önemli ölçüde azaltmıştır10.
Son zamanlarda, R-metillenmiş proteinleri incelemek için çeşitli proteom çapında protokoller optimize edilmiştir. R-metil-peptitlerin immüno-afinite zenginleştirilmesi için antikor tabanlı stratejilerin geliştirilmesi, insan hücrelerinde yüzlerce R-metillenmiş bölgenin ek açıklamasına yol açmıştır11,12. Ayrıca, birçok çalışma 3,13, antikor bazlı zenginleştirmenin HpH-RP kromatografi fraksiyonasyonu gibi peptid ayırma teknikleriyle birleştirilmesinin tanımlanan toplam metil-peptit sayısını artırabileceğini bildirmiştir.
Bu makalede, çeşitli biyokimyasal ve analitik adımlara dayanarak, insan hücrelerinde R-metillenmiş bölgelerin sistematik ve yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanmış deneysel bir strateji açıklanmaktadır: hmSILAC etiketli hücrelerden protein ekstraksiyonu, Tripsin ve LysargiNase proteazları ile paralel çift enzimatik sindirim, ardından sindirilmiş peptitlerin HpH-RP kromatografik fraksiyonasyonu, MMA-, SDMA'nın antikor bazlı immüno-afinite zenginleştirmesi ile birleştiğinde, ve ADMA içeren peptitler. Tüm afiniteyle zenginleştirilmiş peptitler daha sonra DDA modunda yüksek çözünürlüklü Sıvı Kromatografisi (LC)-MS / MS ile analiz edilir ve ham MS verileri, R-metil-peptitlerin tanımlanması için MaxQuant algoritması tarafından işlenir. Son olarak, MaxQuant çıktı sonuçları, ağır ve hafif metil-peptit çiftlerini aramak için şirket içinde geliştirilen bir biyoinformatik araç olan hmSEEKER ile işlenir. Kısaca, hmSEEKER msms dosyasından metil-peptitler tanımlamalarını okur ve filtreler, daha sonra her metil-peptidi allPeptides dosyasındaki karşılık gelen MS1 zirvesiyle eşleştirir ve son olarak ağır / hafif peptid muadilinin zirvesini arar. Her varsayılan ağır-hafif çift için, Log2 H/L oranı (LogRatio), Bekletme Süresi farkı (dRT) ve Kütle Hatası (ME) parametreleri hesaplanır ve kullanıcı tanımlı kesmeler içinde bulunan çiftler gerçek pozitif olarak etiketlenir. Biyokimyasal protokolün iş akışı Şekil 1'de açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürü ve protein ekstraksiyonu (zaman: 3 - 4 hafta gerekli)
- HeLa hücrelerini, sırasıyla Hafif (L) veya Ağır (H) Metiyonin ile sağlanan ortamlarda paralel olarak büyütün (ortam bileşimi için Tablo 1'e bakınız). En az sekiz hücre bölünmesi üzerine, her SILAC kanalından bir hücre aliquot toplayın ve birleştirme testini gerçekleştirin.
NOT: Birleştirme verimliliğini kontrol etmek için, LC-MS/MS analizi ile Ağır kanaldaki ağır Metiyonin (Met-4) yüzdesinin mümkün olduğunca %100'e yakın olduğunu test edin. Ağır etiketli hücrelerin bir aliquot'unu LC-MS/MS ile analiz edin (ayarlar için Tablo 2'ye bakın), ardından Tablo 3'te belirtilen parametreleri kullanarak MS verilerini MaxQuant ile işleyin. Met-4 kuruluşunu kontrol etmek için https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ şirket içi geliştirilmiş bir komut dosyası mevcuttur. - Ağır Metiyonin birleşmesini% >97'ye ulaştığında tamamlanmış olarak düşünün. Her kanal toplam yaklaşık 60 x 10 hücre sayısına ulaştığında6 hücre (HeLa hücreleri için% 85 akıcılıkta her biri 15 cm'lik yaklaşık 40 kabak karşılık gelir, hücre tipine bağlı olarak değişir) bunları toplar. Bunları dikkatlice sayın, 1: 1 oranında karıştırın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 335 x g'de santrifüjleme ile pelet edin.
NOT: Uygun 1: 1 L / H karışımını değerlendirmek için, bir aliquot tutun ve yüksek miktarda ve ağır R-metillenmiş protein (örneğin, fibrillarin) içerdiği bilinen bir jel dilimi üzerinde çalıştırın. Etiketleme başarılı olmuşsa ve 1:1 karıştırma sağlanmışsa, numunede bulunan R-metillenmiş peptitlerin hafif ve ağır versiyonlarının 1:1 oranında olması gerekir. Alternatif olarak, LC-MS / MS tarafından analiz edilecek karışık numunenin bir aliquot'unu tutun, ardından MS verilerini Tablo 3'te belirtilen parametreleri kullanarak MaxQuant ile işleyin ve Şekil 2C'de gösterildiği gibi Log2 H / L oranının dağılımını çizin. Protokol burada peleti kolayca dondurarak ve -80 ° C'de saklayarak durdurulabilir. - Hücre peletini hücre pelet hacmine göre dört hacim Lizis Tamponunda (Lizis Tamponu bileşimi için Tablo 1'e bakınız) yeniden askıya alın. Örneğin, 1,5 mL hacme karşılık gelen 120 x 10 6 Hela hücresinden (60 x 10 6 Işık + 60 x 106 Ağır) bir pelet için6 mL Lizis Tamponu kullanın.
NOT: Protein ekstraksiyonu oda sıcaklığında (RT) yapılmalıdır, çünkü Lizis Tamponu buz sıcaklığında çökelen kaotropik ajan 9 M Üre içerir; Bu nedenle, proteinleri proteolitik bozunma ve defosforilasyona karşı aynı anda korumak için geniş bir Serin ve Sistein proteaz inhibitör spektrumunun yanı sıra fosfataz inhibitörlerinin eklenmesi önemlidir, proteaz ve fosfataz inhibitörlerinin kokteyli küçük tabletler olarak ticari olarak temin edilebilir, bakınız Tablo 1 ve Malzeme Tablosu. - Hücre zarlarının verimli bir şekilde kırılmasını ve DNA salınımını ve kesilmesini sağlamak için numuneyi 15 s ON ve 30 s KAPALI en az beş döngü için bir mikrotip hücre bozucu sonicator ile sonikleştirin. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek ekstraktın viskozitesini kontrol edin. Eksik DNA kesme ve membran çözünürlüğü nedeniyle çok viskoz ise, sonikasyon döngülerini tekrarlayın.
NOT: Numunenin sonikasyon sırasında aşırı ısınmadığından emin olun, çünkü yüksek sıcaklık proteinlere zarar verebilir. Bununla birlikte, 9M Üre varlığı nedeniyle örneği sonikasyon döngüleri arasında buz üzerine koymak mümkün değildir; Bu nedenle, farklı sonikasyon döngüleri arasında 60 s KAPALI için duraklatılması tavsiye edilir. Dahası, sonikasyon sırasında hava kabarcıklarının oluşumundan kaçının çünkü sonikasyon etkinliğini azaltırlar. - Ekstraktı RT'de 10 dakika boyunca 3.000 x g'de santrifüj ederek kalıntıları toplayın ve süpernatantı yeni bir 15 mL tüpe aktarın.
- Ekstraktın protein içeriğini, Bradford veya biskinkoninik asit (BCA) 14,15 gibi kolorimetrik bir tahlille ölçün. Bu protokol için optimal bir başlangıç protein ekstraktı miktarı 20-30 mg arasındadır.
NOT: Yüksek konsantrasyonlu üre içeren lizis tamponları hem Bradford hem de BCA nicelleştirme testi ile uyumludur; Yüksek konsantrasyonda sodyum dodesil sülfat (SDS) içerenler gibi diğer Lizis tamponu türleri Bradford ile uyumlu değildir.
2. Lizat sindirimi (gösterge süresi 2 saat gerektirir)
- 4.5 mM'lik son konsantrasyonda ultra saf suda çözünmüş bir dikitiyotreitol (DTT) stok çözeltisi kullanarak proteinlerin tiol grubunun (-SH) indirgenmesini gerçekleştirin ve reaksiyonun 55 ° C'de 30 dakika boyunca devam etmesine izin verin.
NOT: 1 M stok DTT çözeltisi hazırlamak ve 1 aya kadar -20 ° C'de saklamak mümkündür, böylece her deney için sadece gerekli olan alikotlar çözülür. Alternatif olarak, sülfhidril redüktant tris-(2-karboksiyetil)-fosfin (TCEP), -SH gruplarının indirgenmesini gerçekleştirmek için kullanılabilir; Özellikle proteinlerin uzun süreli depolanması için TCHEP, tamponda EGTA gibi metal şelatları olmayan DTT'den önemli ölçüde daha kararlıdır, oysa metal şelatlar varsa DTT daha kararlıdır16. - 10 mM'lik bir konsantrasyonda iyodoasetamid (IAA) ekleyerek proteinlerin tiol grubunun (-SH) alkilasyonunu gerçekleştirin ve karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Ekstrakte edilen proteinlerin inkübasyonunu karanlıkta IAA çözeltisi ile gerçekleştirin, çünkü IAA ışığa duyarlıdır.
NOT: 100 mM'deki IAA stok çözeltisi her deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır. Alternatif olarak, kloroasetamid, -SH gruplarının alkilasyonunu gerçekleştirmek için kullanılabilir, özellikle de deneyin amacı metilasyon ve ubikitinasyon arasındaki çapraz konuşmayı analiz etmekse, çünkü IAA kaynaklı artefakt ubikitinasyonu taklit eder17. - Protein sindirim adımına geçmeden önce, SDS-PAGE Coomassie boyalı jel üzerinde daha sonraki analizler ve sindirim üzerine karşılık gelen miktarda numune ile karşılaştırma için bir protein ekstraktı (1/1.000 başlangıç yapılmamış lizat) saklayın; Bu test proteoliz etkinliğini doğrulamaya yarar (bkz. nokta 4).
- Kalan protein ekstraktını dört hacim 20 mM HEPES pH 8.0 ile seyreltin, böylece 2 M'lik bir nihai üre konsantrasyonuna (proteazların enzimatik aktivitesi ile uyumlu konsantrasyondur) ulaşın. Numuneyi iki bölüme ayırın: birincisinde Sıralama Sınıfı Modifiye Tripsin ekleyin ve ikincisinde başlangıç malzemesinin mg'ına göre 1:100 (w / w) oranında LysargiNase proteaz ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Enzimatik sindirime izin vermek için gece boyunca 37 ° C'de 600 rpm'de bir termomikserde bırakın.
NOT: Proteomikte en yaygın sindirim enzimi olan tripsin, R ve Lizin'in (K) C-ucunda ayrılır ve çarpışmaya bağlı ayrışma (CID) üzerine y-tipi iyonların hakim olduğu parçalanma spektrumları ile sonuçlanan bir yük dağılımına sahip peptitler üretir. LysargiNase, R ve K'nın N-terminusunda ayrılır, bu nedenle, Tripsin bölünme özgüllüğünü yansıtır ve CID parçalanması üzerine esas olarak b-tipi iyonları serbest bırakan peptitler üretir. Bu kombine analiz, peptid dizisi kapsamının çok artmasına ve R-metilasyonlarının bölgeye özgü tanımlanmasında daha fazla güvene yol açar18.
3. Peptit saflaştırma (gösterge süresi 1 saat gerektirir)
- Her iki reaksiyondan da sindirilmiş peptitlerin bir alikotunu saklayın, proteaz sindirim verimliliğini değerlendirmek için SDS-PAGE Coomassie boyalı jel üzerinde karşılaştırma için madde 2.3'teki ile aynı hacimleri toplayın (bkz. nokta 4).
- Numuneleri% 5'lik bir nihai konsantrasyona trifloroasetik asit (TFA) ilavesiyle asitleştirerek sindirimi durdurun. İyice karıştırın ve numunelerin pH'ını bir turnusol kağıdıyla ölçün (pH yaklaşık 3 olmalıdır). Vorteksi kısaca yapın ve asitlenmiş numuneleri yeni 15 mL tüplere aktarmadan önce döndürün.
- Numuneleri, biri Tripsin ile sindirilen numune için, diğeri LysargiNase ile sindirilen numune için olmak üzere iki C18 vac kartuşundan (sorbent ağırlığı 1 g, Malzeme Tablosuna bakınız) temizleyin. Solvent A, Solvent B ve Yıkama Tamponunu hazırlayın (tampon bileşimi için Tablo 1'e bakınız).
- Cam pipetler kullanarak, her kartuşu 6 mL ACN ile 3 kez %100 oranında rehidre edin. Bundan sonra, her kartuşu sırayla 3-9-18 mL Solvent A ile dengeleyin. numuneleri yükleyin (reçineler sarı olmalıdır). 3-9-18 mL Solvent A ile sırayla tekrar yıkayın ve ardından 6 mL Yıkama tamponu ekleyin. Her bir sütunu temiz 15 mL tüplere aktarın ve numuneleri 7 mL Solvent B ile süzün. 14 mL'lik son hacim için elüsyon adımını 7 mL Solvent B ile tekrarlayın.
NOT: Tüm bu adımları, tamponların ve çözeltinin sütunlardan yerçekimi ile geçmesine izin vererek gerçekleştirin. Tamponların kolondan akışını desteklemek için, vakumu taklit etmek için her çözeltiyi bir şırınga ile yavaşça itin. - SDS-PAGE tarafından sonraki peptid değerlendirmesi için 50 μL salınımlı peptit, 50 μL akış (FT), Solvent A ile yıkamanın 50 μL'si ve son yıkamanın 50 μL'sini kaydedin (bkz. madde 4).
4. Coomassie boyalı SDS-PAGE jel (gösterge süresi 2 saat gerektirir)
- Toplanan alikotları% 17,5'lik bir SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırın ve Instant-Blu Coomassie boyama ile boyayın (bkz. Beklenen sonuç Şekil 2A'da gösterilmiştir.
5. Peptit liyofilizasyonu (gösterge süresi 2 gün)
- Salınımlı peptitleri içeren 15 mL tüpleri parafin filmi ile örtün, daha sonra 3-5 delik oluşturmak için 20 G'lik bir iğne ile delinir. Tüpleri, numuneler tamamen donana kadar en az 30 dakika kuru buz içine koyun.
- Dondurulmuş fraksiyonları, dondurarak kurutucu performansı nedeniyle bazı değişkenlikler meydana gelse bile, numunelerin tam liyofilizasyonunu sağlamak için tipik olarak yeterli bir zaman aralığı olan 48 saat boyunca liyofilize edin.
NOT: Deney burada duraklatılabilir ve liyofilize numuneler -80 °C'de saklanabilir.
6. Peptitlerin çevrimdışı HpH-RP kromatografik fraksiyonasyonu (gösterge süresi 4 gün)
- Peptitleri 60 fraksiyona ayırmak için, C12-RP HPLC sütunu (250 x 4.6 mm, 4 μm Proteo 90A) ile donatılmış HPLC sistemini kullanarak HpH-RP sıvı kromatografisini kullanın.
- Çalıştırmadan önce, taze Tampon A ve Tampon B hazırlayın (Tamponların bileşimi Tablo 1'de açıklanmıştır).
- Tüm çözeltiyi 0,22 μm filtre ile filtreleyin ve en az 30 dakika boyunca bir sonicator banyosunda gazını çözün.
- Liyofilize peptitleri 1 mL Tampon A'da çözün Peptitleri bir şırınga kullanarak bir politetrafloroetilen (PTFE) 0.45 μm filtreden süzün.
- Fraksiyonasyon hızını 1 mL/dak akışa ayarlayın ve aşağıdaki kromatografik gradyanı kullanarak 1 mL fraksiyon toplayın: 60 dakikada %5 B ila %30 B; 2 dakika içinde% 30 B'den% 60'a; 3 dakika boyunca %70 B
- HPLC'yi, bu noktada, fraksiyon toplama durdurulacak ve gradyan, %100 Tampon B'ye kadar hızlı bir gradyanla sütunun kapsamlı bir şekilde yıkanmasından önce 5 dakika boyunca %70 Tampon B'de tutulacak ve ardından son bir yıkama (10 dakika boyunca %100 Tampon B) olacak şekilde ayarlayın.
NOT: Her kromatografik çalışmanın sonunda, sütunu her zaman 20 dakika boyunca% 100 Arabellek A ile dengeleyin. - Her iki numuneyi, madde 6.5'te açıklandığı gibi, Off-Line HpH RP kromatografik gradyanları ile Tripsin ve LysargiNase ile ayrı ayrı sindirilmiş olarak fraksiyone edin.
- Her kromatografik gradyan için, tüm fraksiyonları derin bir 96 kuyucuk plakasında toplayın.
- Degradeden önce toplanan kesirleri PRE adlı tek bir kesirde toplayın. HpH-RP sıvı kromatografik (LC) gradyanından 60 fraksiyonu, bitişik olmayan bir şekilde 14 son fraksiyonda birleştirerek birleştirin. Bu tür bitişik olmayan birleştirmeyi elde etmek için, HpH-RP fraksiyonlarını aşağıdaki şemaya göre bir araya getirin.
- Fraksiyon 1 (son cilt 5 mL): Havuz 1-15-29-43-57
- Fraksiyon 2 (son cilt 5 mL): Havuz 2-16-30-44-58
- Fraksiyon 3 (son cilt 5 mL): Havuz 3-17-31-45-59
- Fraksiyon 4 (son cilt 5 mL): Havuz 4-18-32-46-60
- Fraksiyon 5 (son cilt 4 mL): Havuz 5-19-33-47
- Fraksiyon 6 (son cilt 4 mL): Havuz 6-20-34-48
- Fraksiyon 7 (son cilt 4 mL): Havuz 7-21-35-49
- Fraksiyon 8 (son cilt 4 mL): Havuz 8-22-36-50
- Fraksiyon 9 (son cilt 4 mL): Havuz 9-23-37-51
- Fraksiyon 10 (son cilt 4 mL): Havuz 10-24-38-52
- Fraksiyon 11 (son cilt 4 mL): Havuz 11-25-39-53
- Fraksiyon 12 (son cilt 4 mL): Havuz 12-26-40-54
- Fraksiyon 13 (son cilt 4 mL): Havuz 13-27-41-55
- Fraksiyon 14 (son cilt 4 mL): Havuz 14-28-42-56
NOT: Bitişik olmayan birleştirme, havuzlanmış fraksiyonlar içindeki peptid bileşimindeki heterojenliğin arttırılmasına izin veren erken, orta ve geç salınımlı fraksiyonların birleştirilmesinden oluşur. Sonuç olarak, havuzlanmış her fraksiyonun peptid karışımı, kütle spektrometresine doğrudan bağlanmış sonraki nano akışlı düşük pH-RP-LC kromatografisinde, sınırlı ko-elüsyon ile verimli bir şekilde ayrılır.
- Degradeden sonra toplanan kesirleri POST adlı benzersiz bir kesirde toplayın.
NOT: PRE ve POST gradyanı fraksiyonları dahil edilerek, 15 mL tüplerde toplam 16 fraksiyon elde edilir (bkz. Şekil 3A). - 15 mL tüpleri parafin film ile örtün ve 3-5 delik oluşturmak için 20 G'lik bir iğne ile delin. Santrifüj tüplerini kuru buzda inkübe ederek her fraksiyon tamamen donana kadar dondurun.
- Fraksiyonları yaklaşık 48 saat boyunca liyofilize edin. Dondurarak kurutucuyu durdurmadan önce her numunenin tamamen kuruduğundan emin olun.
NOT: Deney burada duraklatılabilir ve liyofilize numuneler -80 °C'de saklanabilir.
7. R-metillenmiş peptid immüno-afinite zenginleştirme (gösterge süresi 2 gün)
- Modifiye peptidin anti-pan-R-metilasyon antikorları ile sıralı immüno-afinite zenginleştirmesini paralel olarak, ancak sırasıyla Tripsin ve LysargiNase sindirimlerinden alınan iki örnek için ayrı ayrı gerçekleştirin. İmmüno-Afinite Saflaştırma (IAP) Tamponu, modifiye peptid afinite zenginleştirmesi için anti-pan-R-metil antikorlarını satın alan şirket tarafından sağlanır (ayrıntılar Tablo Materyali ve Reaktifler'dedir). IAP tamponu 10x konsantre edilmiştir ve kullanımdan önce 10 kez seyreltilmelidir.
NOT: IAP Arabellek 1x, -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. - Peptitleri 15 mL tüpün dibine doğru döndürmek için RT'de 5 dakika boyunca liyofilize peptitleri 2.000 x g'de santrifüj edin. Liyofilize peptitleri 15 mL tüp başına 250 μL 1x IAP Tamponu ile tekrar askıya alın ve 1.5 mL düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın. Bir turnusol kağıdı kullanarak pH'ın >6 olup olmadığını kontrol edin.
- Sonraki MS analizi için girdi olarak her fraksiyonun küçük bir aliquot'unu (hacmin yaklaşık% 5'i) tutun.
- Asimetrik di-metillenmiş (ADMA) ve simetrik olarak di-metillenmiş (SDMA) peptitlerin immüno-zenginleştirmesini paralel olarak gerçekleştirmek için her fraksiyonu iki alikotta bölün.
- İlk protein ekstraktının 10 mg'ı başına protein A agaroz boncuklarına konjuge edilmiş seçilmiş anti-pan-R-metillenmiş antikorların üç şişesini kullanın.
- Her bir şişeyi 2.000 x g'de 30 s boyunca santrifüj ederek ve tamponu boncuklardan çıkararak agaroz boncuklarına konjuge edilmiş doğru antikor miktarını hazırlayın. Boncukları her zaman 1 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın, 30 s boyunca 2.000 x g'de santrifüj yapın.
- Son yıkamadan sonra, boncukları her şişe için 40 μL 1x PBS'de tekrar askıya alın; onları bir araya getirin ve sonunda 16 fraksiyona eşit olarak bölün (böylece her fraksiyona 2.5 μL antikor-boncuk eklenir).
- Her tüpe 250 μL 1x IAP Tamponu ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve 4 ° C'de 2 saat boyunca dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edilmesine izin verin.
NOT: Numuneleri, boncuklara zarar verebilecek veya kaybetmelerine neden olabilecek mikro uçlarla pipetlemek yerine 1,5 mL'lik tüpleri ters çevirerek karıştırın. - 2 saatlik inkübasyonda, peptitler ve pan-R-metil-antikor-konjuge boncuklar içeren 1.5 mL tüpleri, boncukları peletlemek için 30 s boyunca 2.000 x g'de santrifüj yapın; FT'yi her fraksiyondan temiz 1,5 mL düşük bağlayıcı tüplere aktarın.
- R-mono-metilasyona (MMA) karşı antikorlara konjuge edilmiş boncukları FT'lere ekleyin ve 7.7 ila 7.9 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Peptit örneklerinin MMA-boncuklarla inkübasyonu sırasında, daha önce anti-ADMA ve SDMA ile immüno-çökeltilmiş fraksiyonların iki katını 250 μL IAP Tamponu ile yıkayın (ters çevirme ve pipetleme değil) ve her yıkamada süpernatantı atın.
- LC-MS derece H2O ile yıkamayı üç kez tekrarlayın.
- Her tüpe 50 μL% 0.15 TFA ekleyerek agaroz boncuklarından afinite bakımından zenginleştirilmiş simetrik ve asimetrik olarak R-di-metillenmiş peptitleri etkisiz hale getirin (güçlü asit koşulları, aslında, antijenlerin antikorlardan salınmasına yol açan epitopu denatüre eder). Bu çözeltiyi RT'de 10 dakika bırakın, tüpleri her 2-3 dakikada bir ters çevirin.
- İlk elüsyonu temiz 1,5 mL düşük bağlayıcı tüplere aktarın ve elüsyonu 50 μL% 0,15 TFA ile tekrarlayın; 2 fraksiyonu bir tüpte toplayın.
- Anti-MMA antikor-boncukları ile inkübe edilen R-mono-metillenmiş peptitler için 7.11 ila 7.14 arasındaki adımları tekrarlayın.
8. Afinite ile zenginleştirilmiş metil-peptitlerin C18 mikrokolonları ile tuzdan arındırılması ve konsantrasyonu (gösterge süresi 30 dakika gerektirir)
- MS analizi19'dan önce peptid tuzdan arındırma ve konsantrasyon için 3M Katı Faz ekstraksiyon kartuşları ile yapılan C18-RP mikrokolonlarını metanol ile dengeleyin.
- Numuneleri (ayrı immüno-afinite ile zenginleştirilmiş fraksiyonlara ve giriş fraksiyonlarına karşılık gelen) C18 mikrokolonlarına iki adımda (her C18 mikrokolonunda 50 μL + 50 μL) 6 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yaparak yükleyin.
- Mikrokolonları 55 μL Tampon A ile yıkayın (tampon bileşimi için Tablo 1'e bakınız), her zaman 5 dakika boyunca yaklaşık 900 x g'de santrifüjleme yoluyla.
NOT: Deney burada duraklatılabilir ve C18-RP mikrokolonları 4 °C'de bırakılarak 2 haftaya kadar saklanabilirler.
9. İkinci enzimatik sindirim (gösterge süresi 3 saat gerektirir)
- C18-RP mikrokolonlarını 55 μL Tampon A ile iki kez yıkayın (tampon bileşimi için Tablo 1'e bakınız), 5 dakika boyunca yaklaşık 850 x g'de santrifüjleme yoluyla.
- Peptitleri 20 μL Tampon B ile iki kez süzün (tampon bileşimi için Tablo 1'e bakınız) ve iki fraksiyonu bir araya getirin.
- Salınımlı peptitleri bir vakum yoğunlaştırıcısında kurutun (ayrıntılar için Tablo Malzemesi ve Reaktifleri'ne bakınız). Bu arada, taze yapılmış 1 M stok çözeltisinden seyreltilmiş 50 mM amonyum bikarbonattan oluşan sindirim çözeltisini hazırlayın (bkz. Tablo 1).
- İlgili numunelere, 25 ng / μL'lik son konsantrasyona Tripsin veya LysargiNase ekleyin.
- Sindirimi durdurmak için 1 μL% 5 TFA ekleyin; vorteks ve numuneleri aşağı doğru döndürün.
NOT: Tripsin tarafından enzimatik bölünme, metillenmiş R ve K'nın C-ucunda inhibe edilebilir, bu da peptid uzunluğunu ve yükünü artıran kaçırılmış bölünmelere neden olur, bu da peptid tanımlamasını ve metilasyon bölgelerinin bölgeye özgü atfedilmesini engelleyen karmaşık ve eksik parçalanma spektrumları üretir. İkinci bir enzimatik sindirimin, bu tür kaçırılmış bölünmelerin sıklığını azaltabileceği, gelişmiş dizi kapsamı ve saha ilişkilendirmesi20 ile gösterilmiştir.
10. Tuzdan arındırma peptidleri (gösterge süresi 30 dakika gerektirir)
- Asitleştirilmiş peptit çözeltilerini, madde 8'de açıklanan aynı adımları izleyerek daha önce dengelenmiş olan yeni C18-RP mikrokolonlarına yükleyin.
- C18-RP mikrokolonlarına yüklenen peptid, LC-MS / MS analizi için elüsyona kadar 4 ° C'de saklanabilir.
11. Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizi (gösterge süresi 5 gün)
- Peptitleri C18-RP mikrokolonlarından 10μL Tampon B'yi geçirerek, RT'de 5 dakika boyunca 615 x g'de santrifüj yaparak süzün. Bu adımı iki kez tekrarlayın ve eluateleri birleştirin.
- Bir vakum yoğunlaştırıcısındaki elüatların hacmini neredeyse kuruyana kadar azaltın ve aşırı kurumayı önleyin.
- LC-MS/MS analizi için peptitleri 10 μL Tampon A'da tekrar askıya alın.
- R-metil-peptitlerin her bir fraksiyonunu, nano akışlı ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UHPLC) sistemine bağlı olarak, yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometresinde (bkz. Malzeme Tablosu) sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) ile analiz edin. Cihaz parametrelerini Tablo 2'de açıklandığı gibi ayarlayın.
- Her numunenin 2 μL'sini, C18-RP reçine (2 μm partikül boyutu) ile paketlenmiş bir nano-analitik kolona (kolay püskürtme sütunu 75 μm iç çap, 25 cm uzunluk) yükleyin.
- Numuneler C18 RP nano-kolonundan 300 nL/dak akış hızında geçirilir ve aşağıdaki doğrusal gradyan uygulanır: 89 dakika için %3-%30 B, 5 dakika için %30-%60 B, 1 dakika için %60-%95 B ve 5 dakika boyunca %95 B.
- Kütle spektrometresi, tam tarama MS ve MS/MS alımı arasında otomatik olarak geçiş yapmak için veriye bağımlı toplama (DDA) modunda çalışır. Spektrometre dedektöründe analiz edilecek anket tam tarama MS'sini R = 70.000 çözünürlüğünde ayarlayın. En yoğun on beş peptid iyonu, 3 x 106'lık bir hedef değere sırayla izole edilir ve% 28'lik göreceli çarpışma enerjisi ile parçalanır. İzin verilen maksimum iyon biriktirme sürelerini tam taramalar için 20 ms'ye ve MS/MS için 50 ms'ye ayarlayın ve MSMS için hedef değeri 1 x 106 olarak sabitleyin. Dinamik hariç tutma süresi 20 sn olarak ayarlanır.
12. MaxQuant ve hmSEEKER veri analizinin çalıştırılması
- LC-MS / MS çalıştırmalarının tamamlanmasının ardından, metil-peptitleri referans veritabanına karşı olasılık tabanlı yaklaşımla tanımlamak için MS ham verilerini bir peptid arama motoruna aktarın. Bu protokolde analizimiz için MaxQuant versiyon 1.6.2.10 kullanılmıştır. MaxQuant'ın çalışması için en az 2 GB RAM'in yanı sıra tüm ham verileri ve tüm çıktı dosyalarını depolamak için yeterli disk alanı gerekir.
NOT: Kurulum, donanım ve yazılım gereksinimleri hakkında tüm ayrıntılar için https://www.maxquant.org adresindeki resmi belgelere bakın. - Her ham veri dosyasını çoğaltın. Orijinalleri, adlarına "_light" ekleyerek yeniden adlandırın, ardından "_heavy" ekleyerek kopyaları yeniden adlandırın.
NOT: hmSEEKER, aşağı akış analizi için komut dosyası, büyük/küçük harfe duyarlıdır. - Tablo 3'te belirtilen ayarlarla peptid tanımlaması için MaxQuant/Andromeda aramasını başlatın. MaxQuant tarafından üretilen birkaç çıktı verisinden yalnızca allPeptides.txt ve msms.txt dosyaları (birleştirilmiş/txt alt klasöründe bulunur) işlem sonrası adım için gereklidir.
- MaxQuant çıktı verilerinin son işlenmesi hmSEEKER algoritması tarafından gerçekleştirilir. hmSEEKER'ı şuradan indirin: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Betik, Python 3.7'de yazılmış bir Jupyter not defteri olarak kullanılabilir ve test amacıyla örnek bir veri kümesiyle birlikte gelir. Yeni kullanıcılar için, Anaconda platformunu (https://www.anaconda.com/products/individual) indirip yüklemeniz önerilir. En son sürüm varsayılan olarak Python 3.8, Jupyter ve hmSEEKER'ı çalıştırmak için gereken tüm paketleri içerir (örneğin, Scikit-learn 0.23.1).
- Bir klasör oluşturun ve MaxQuant çıktısından allPeptides.txt ve msms.txt dosyalarını saklayın.
- Jupyter'ı başlatın (komut satırından veya Anaconda navigatörden).
- hmSEEKER klasörüne gidin ve hmSEEKER.ipynb dosyasını açın.
- Not defterinin Giriş Parametreleri bölümünde, FASTA veritabanına ve MaxQuant metin dosyalarını içeren klasörlere giden yolları belirtin.
- Hücreyi seçip Jupyter arayüzünün üstündeki Oynat düğmesine tıklayarak her hücrenin içindeki kodu çalıştırın.
- Betik, analiz edilen her veri kümesi için virgülle ayrılmış bir çıktı dosyası ve birleştirilmiş bir dosya oluşturur. Son çiftler listesi "[tarih]-[saat]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv" adlı dosyada bulunabilir.
(Tablo 4 , çıktı tablosundaki sütunların kısa bir açıklamasını içerir).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Makalede, protein ekstraktının enzimatik sindiriminin paralel olarak iki ayrı proteaz ile kombinasyonuna dayanan küresel protein R-metilasyonunun yüksek güvenilirlikte tanımlanması için bir iş akışı anlatılmaktadır, bunu proteolitik peptitlerin HpH-RP sıvı kromatografisi fraksiyonasyonu ve R-metil-peptidlerin anti-pan-R-metil antikorları ile immüno-afinite zenginleştirmesi izlemektedir (Şekil 1).
Hücreler, doğal (Hafif, L, Met-0) veya izotopik olarak etiketlenmiş (Ağır, H, Met-4) Metionin varlığında yetiştirildi. MS analizi ile sadece Met-4 ekstraktının küçük bir alikotu üzerinde test edilen tam izotopik etiketleme üzerine, ağır ve hafif hücreler hasat edildi ve Şekil 1A'da gösterildiği gibi 1: 1 L / H oranında karıştırıldı. 13CD 3-metiyonin metabolik etiketlemesi üzerine, metil grupları, metil-donör S-adenosil-metiyoninden (SAM) protein omurgasına eklenir ve hafif veya ağır izotop formu21'de bulunur. Şekil 1B, bir metil grubunun S-adenosil metiyoninden (SAM) arginin guanidino azotuna transferini katalize eden Protein Arginin Metiltransferazlar (PRMT'ler) ailesi tarafından gerçekleştirilen arginin metilasyon reaksiyonunu açıklamaktadır. Arjininin terminal azot atomlarından birine tek bir metil grubu yerleştirilirse, mono-metillenmiş arginin (MMA) elde edilir. Guanidino grubunun aynı azot atomuna iki metil grubu eklenirse, asimetrik di-metillenmiş arginin (ADMA) üretilirken, iki farklı azot atomuna iki metil grubu yerleştirilirse, simetrik di-metillenmiş arginin (SDMA) üretilir.
1: 1 oranında hafif ve ağır etiketli hücrelerde karıştırıldıktan sonra, proteinler paralel olarak Tripsin ve LysargiNaz tarafından ekstrakte edildi ve sindirime tabi tutuldu. Şekil 2'de gösterildiği gibi, SDS-PAGE Coomassie boyalı jel, peptitlerdeki toplam proteinlerin verimli enzimatik sindirimini doğrulamak için kullanılmıştır (şerit I ve II'yi karşılaştırın). Ayrıca, C18 Sep-Pak sütunu tarafından gerçekleştirilen saflaştırma adımının etkinliği değerlendirilerek, C18 kolonunun akışında (Şekil 2, şerit III) ve birinci ve ikinci yıkamada (sırasıyla Şekil 2 şerit IV ve V) peptidlerin bulunmadığı ve elüatta beklenen mevcudiyetleri doğrulanmıştır (Şekil 2, şerit VI). Ağır kanala uygun Met-4 entegrasyonu (Şekil 2B) ve doğru 1:1 H/L miksajı (Şekil 2C) değerlendirildi.
Şekil 3, peptidlerin çevrimdışı HpH-RP sıvı kromatografisi fraksiyonasyonundan kromatogramı ve ardından fraksiyonların bitişik olmayan birleşimini göstermektedir. Peptitler 215 nm UV ile tespit edilirken, potansiyel olarak kalan sindirilmemiş proteinler 280 nm UV ile değerlendirildi. Kromatogramın altında, 70 başlangıç fraksiyonunu PRE ve POST gradyan fraksiyonları da dahil olmak üzere son 16'ya düşürmek için fraksiyon birleştirme stratejisi şematize edilmiştir.
R-metil-peptitlerin zenginleştirilmesi için anti-pan-R-metil antikorlar kullanıldı. Bu antikorlar üç tip R-metilasyonunu (MMA, SDMA ve ADMA) tanır ve agaroz boncuklarına doğrudan konjuge olarak ticari olarak temin edilebilir (ayrıntılar için Tablo Malzemesi ve Reaktifleri'ne bakınız). Tablo 1 , bu protokolde kullanılan tüm arabellekleri ve çözümleri listeler.
Elde edildikten sonra, her MS ham verisi, farklı arama gruplarındaki hafif ve ağır metilasyonları tanımlamak için MaxQuant ile iki kez analiz edildi ve metil-peptitlerin (ağır ve hafif) yalnızca belirli bir grupta tanımlanacağı gerekçesiyle analiz edildi. Ağır ve hafif metilasyonların ayrı ayrı araştırılması, sunulan değişken modifikasyonların sayısını azaltarak ve yanlış pozitif karışık etiketli peptitlerin riskini azaltarak analizi geliştirir. MaxQuant metil bölgeleri atadıktan sonra, hmSEEKER olası ağır-hafif tepe çiftlerini yeniden yapılandırmak için çıktı tablosunu ayrıştırır13.
Şekil 4 ve 5, sırasıyla Gerçek Pozitif ve Yanlış Pozitif metil-peptid ek açıklamasını temsil eden peptitler FELTGIPPAPR(me) (4) ve NPPGFAFVEFEDPR(me) (5)'in tam MS spektrumlarını göstermektedir. Şekil 4'te, üç tepe noktası arasında gözlenen m/z farkları, enzimatik olarak metillenmiş bir kalıntının varlığı ile tutarlıdır (modifiye edilmemiş ve hafif metillenmiş arasında 7.0082 Th; metil-peptidin hafif ve ağır formları arasında 2.0102 Th). Elde edilen hmSILAC çiftleri 0.40 ppm'lik bir ME'ye, 0.00 dakikalık bir dRT'ye ve -0.41'lik bir LogRatio'ya sahiptir; Bu değerler, hmSEEKER tarafından doğru ve yanlış çiftleri ayırt etmek için kullanılan varsayılan eşiklerin altındadır ve daha önce aşağıdaki gibi olduğu tahmin edilmektedir: | ME| < 2 sayfa, |dRT| < 0,5 dk ve | LogRatio| < 1. Şekil 5'te gösterilen ikinci durumda, hafif metillenmiş peptid ile varsayılan ağır karşılığı arasında gözlenen m/z farkı, beklenen değerden 0.0312 Th (ME = -37.28 ppm) sapmaktadır. Dahası, bu çift, varsayılan LogRatio tahmin aralığının dışında kalan 2.50'lik bir LogRatio'ya sahiptir (bu kesme değerleri13'te tanımlanmış ve tartışılmıştır). Aslında, MS / MS spektrumunda, peptid NPPGFAFVEFEDPR (me) dizisi tam olarak örtülmemiştir ve atanan R-metilasyonu, R'ye yakın glutamat veya aspartat üzerinde bir metil-esterifikasyon olarak da yorumlanabilir.
hmSEEKER iş akışı Şekil 6'da şematize edilirken, Tablo 4 , sonuçların yorumlanmasına yardımcı olmak için bu araç tarafından üretilen çıktı tablosunun bir tanımını sağlar: birden fazla modifikasyon taşıyan peptitler birden çok kez görünür, her giriş belirli bir peptid üzerinde farklı bir metilasyon olayına karşılık gelir; Son olarak, tepe çiftleri üç Sınıfa ayrılır: Peptit hem ağır hem de hafif formda parçalandığı ve tanımlandığı için eşleşen çiftler en güvenli olanlardır.
Şekil 1: Deneysel iş akışının ve enzimatik protein-R-metilasyon reaksiyonlarının şeması. (A) Biyokimyasal protokolün iş akış şeması. Hücreler hafif (Met-0) ve ağır (Met-4) Metiyonin içeren ortamlarda en az 8 katına çıkarılarak yetiştirilir ve hafif ve ağır kanallar 1:1 oranında karıştırılır. Proteinler paralel olarak Tripsin veya LysargiNase ile ekstrakte edilir ve sindirime tabi tutulur ve 70 fraksiyon toplanarak çevrimdışı HpH-RP sıvı kromatografisi ile fraksiyone edilir, son olarak 16 fraksiyonda birleştirilir. R-metil-peptitler, agaroz boncuklarına konjuge edilmiş, ikinci enzimatik sindirime (sırasıyla Tripsin veya LysargiNase) maruz kalan anti-pan-R-metil antikorları ile zenginleştirilir ve LC-MS / MS tarafından analiz edilir. MaxQuant çıktı verileri daha sonra ağır ve hafif metil-peptit ilişkisi için şirket içinde geliştirilen hmSEEKER biyoinformatik aracı tarafından analiz edilmek üzere sunulur. (B) R-metilasyon reaksiyonunun şeması. Guanidino arginin grubu, mono-metillenmiş arginin (MMA) üreten bir metil grubunun eklenmesiyle veya simetrik (SDMA) veya asimetrik (ADMA) di-metillenmiş arginin üreten iki metil grubunun eklenmesiyle değiştirilebilir. Reaksiyon, bu metil gruplarını S-Adenosil-Metiyonin'den (SAM) transfer eden Protein Arginin Metiltransferazlar (PRMT'ler) ailesinin enzimleri tarafından katalize edilir. Metil grubu transferinden sonra, SAM S-adenosilhomosistein (SAH) 'ye indirgenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Protokol kritik adımlarının denetimleri. (A) Proteolitik sindirim etkinliğinin değerlendirilmesi için SDS-PAGE Coomassie boyalı jel. MW: moleküler ağırlık belirteçleri. I) BCA tarafından ölçülen sindirimden önce 20 μg toplam H / L protein ekstresi; II) I'de olduğu gibi aynı oranda yüklenen sindirilmiş peptitler; III) Şerit I ile aynı oranda yüklenen C18 kartuşunun akışı; IV-V) C18 kartuşunun birinci ve ikinci yıkaması, I ile aynı oranda yüklenen tampon A ile; VI) I. (B) Met-4 birleştirme hızı analizi ile aynı oranda yüklenen C18 kartuşundan çıkar. Ağır kanaldaki Met-4 birleşmesi, şirket içi geliştirilen komut dosyası (https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/'de mevcuttur) ile değerlendirilir; oran = 1, 1: 1 karıştırma değerlendirmesi için H / L oranlarının tam birleşmesini (C) Gauss dağılımını gösterir. Log2 H/L oranının normal dağılımı ±2σ dikkate alınarak çizilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HpH fraksiyonu birleştirme şeması ve temsili R-metillenmiş peptitler zenginleştirme değerlendirmesi. (A) Yüksek pH-Ters Faz fraksiyonasyon kromatogramı ve bitişik olmayan fraksiyon birleştirme şeması. Kromatogram, 215 nm UV'de (mavi çizgi) tespit edilen peptitlerin HpH-RP ayırma profilini temsil ederken, sindirilmemiş proteinlerin varlığı 280 nm UV kanalında (kırmızı çizgi) izlenmiştir. Açık yeşil çizgi, kromatografik çalışma boyunca Tampon B konsantrasyonunu temsil eder. PRE ve POST gradyan fraksiyonları da dahil olmak üzere 70 ila 16 arasında erken, orta ve geç salınımlı fraksiyonların bitişik olmayan birleştirme stratejisini gösteren kesir havuzu şeması bildirilmiştir. (B) R-metillenmiş peptitlerin zenginleştirilmesini özetleyen Temsili Tablo. Tablo, toplam peptit sayısını ve R-metilasyon zenginleştirmesinin nispi yüzdesini, Girişindeki her IP'yi karşılaştırarak özetlemektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Gerçek hmSILAC çifte örneği. Gerçek bir pozitif çiftin kütle spektrumu. Görüntülenen pikler, değiştirilmemiş, hafif mono-metillenmiş (CH 3) ve ağır mono-metillenmiş (13CD3) formlardaki peptid FELTGIPPAPR'a karşılık gelir, yük 2 + ile. Üç tepe noktası arasında gözlenen m/z farkları, enzimatik olarak metillenmiş bir kalıntının varlığı ile tutarlıdır. Kütle spektrumunun altındaki tablo hmSEEKER çıktısını temsil eder ve çiftin LogRatio, ME ve dRT parametrelerini içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yanlış hmSILAC çifte örneği. Negatif bir in vivo metil-peptit atamasının kütle spektrumu. 811.3849 m / z ve 818.3927 m / z'deki zirveler, peptid NPPGFAFVEFEDPR'in değiştirilmemiş ve hafif mono-metillenmiş formlarına karşılık gelir, 2+ yüklüdür. Üçüncü zirve, hafif metillenmiş peptidin ağır-metil-muadili olarak atanabilir, ancak gözlemlenen m / z kayması, beklenen kaymadan 0.0312 Th ile farklıdır ve bu da bu olasılığı dışlar. Kütle spektrumunun altındaki tablo hmSEEKER çıktısını temsil eder ve çiftin LogRatio, ME ve dRT parametrelerini içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Veri analizi iş akışının şematik gösterimi . (A) MaxQuant, ham verilerdeki MS1 tepe noktalarını algılar. (B) İlişkili bir MS2 spektrumuna sahip zirveler, bir peptit tanımlaması elde etmek için veritabanı arama motoru Andromeda tarafından işlenir. (C) hmSEEKER, MaxQuant peptid tanımlamalarını okur ve metil-peptidleri Andromeda Skoru > 25, Delta Skoru > 12 ve Lokalizasyon Olasılığı 0.75 > modifikasyonları ile çıkarır. (D) Kalite filtrelemesini geçen her metil-peptit için, hmSEEKER MaxQuant allPeptides tablosunda karşılık gelen MS1 zirvesini bulur ve ardından aynı tabloda karşılığını arar. (E) Zirvelerin iki katı, tutma sürelerindeki (RT), yoğunluk oranlarındaki (LogRatio) ve beklenen ve gözlemlenen delta kütlesi (ME) arasındaki sapma ile tanımlanır; Bu üç parametre, hmSEEKER tarafından tartışıldığı gibi gerçek pozitifleri yanlış pozitiflerden ayırt etmek için kullanılır13. (F) Son olarak, hmSEEKER gereksiz ve gereksiz olmayan çiftlerin listelerini üretir; Birincisi, tüm metil-peptitler için tahminleri içerirken, ikincisi filtrelenir, böylece bir peptit birden çok kez tanımlandığında, yalnızca en iyi puanlama çifti rapor edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Arabellek | Hacim | Kompozisyon |
| L-metiyonin (L) çözeltisi | 10mL | Ultra saf suda 30mg / mL Işık-Metiyonin |
| L-metiyonin (H) çözeltisi | 10mL | Ultra saf suda 30mg/mL Ağır-Metiyonin |
| Hücre kültürü için ortam | 500mL | Stabil glutamin içeren ve metiyonin içermeyen DMEM,% 10 (v / v) diyalize FBS,% 1 (v / v) P / S, 1:1000 (v / v) L-metiyonin çözeltisi |
| Lizis Tamponu | 50mL | 9M Üre, 20mM HEPES pH 8.0;1% (v/v) Proteaz İnhibitörü; Ultra saf suda %1 (v/v) Fosfataz İnhibitörü |
| Amonyum Bikarbonat (AMBIC) çözeltisi | 50mL | Ultra saf suda 1M (NH4)2CO3 |
| DTT çözümü | 10mL | Ultra saf suda 1.25M DTT |
| IAA çözümü | 5mL | Ultra saf suda 109mM |
| Sep-Pak C18 için Solvent A | 50mL | Ultra saf suda %0,1 TFA |
| Sep-Pak C18 için Solvent B | 50mL | Ultra saf suda %0,1 TFA + %40 ACN |
| Sep-Pak C18 için yıkama çözeltisi | 50mL | Ultra saf suda %0,1 TFA + %5 ACN |
| HpH fraksiyonasyonu için Tampon A | 500mL | Ultra saf suda 25 mM NH4OH |
| HpH fraksiyonasyonu için Tampon B | 500mL | Ultra saf suda 25 mM NH4OH+% 90 ACN |
| IP bağlama arabelleği 1x | 5mL | 10x ticari olarak stokta bulunan 10x çözeltiden ultra saf suda 1:10 (v/v) seyreltme |
| IP elüsyon arabelleği | 50mL | Ultra saf suda %0,15 TFA |
| Aşama İpuçları için Arabellek A | 50mL | Ultra saf suda %0,1 TFA |
| Aşama İpuçları için B Arabelleği | 50mL | Ultra saf suda %0,1 TFA + %40 ACN |
| Aşama İpuçları için C tamponu | 50mL | Ultra saf suda %0,1 TFA + %50 ACN |
| MS Solvent A | 250mL | Ultra saf suda %0,1 FA |
| MS Solvent B | 250mL | Ultra saf suda %0,1 FA + %80 ACN |
| Proteaz inhibitörleri kokteyli | 5 mL | cOmplete, EDTA içermeyen Proteaz İnhibitörü Tabletleri (ROCHE), üretim talimatına göre ultra saf suda çözülür |
| Fosfataz inhibitörleri kokteyli | 5 mL | Üretim talimatına göre ultra saf suda çözünmüş PhosSTOP Tabletleri (ROCHE) |
Tablo 1: Tamponlar ve çözelti bileşimi. Bu protokolde kullanılan tamponların ve çözeltilerin listeleri.
| Parametre | Değer |
| Numune Yükleme (uL) | 2 |
| Yükleme Akış Hızı (uL/dak) | 10 |
| Degrade Akış Hızı (nL / dak) | 300 |
| Lineer Degrade | 89 dakika için %3-30 B, 5 dakika için %30-60 B, 1 dakika için %60-95 B, 5 dakika için %95 B |
| Tam Tarama Çözünürlüğü | 70,000 |
| Seçilen en yoğun iyon sayısı | 15 |
| Bağıl Çarpışma enerjisi (%) (CID) | 28 |
| Dinamik Hariç Tutma | 20.0 |
Tablo 2: LC-MS/MS ayarı. Yüksek çözünürlüklü bir Quadrupole-Orbitrap Kütle Spektrometresi üzerinde R-metil-peptitlerin LC-MS / MS analizi için uygulanan parametreler, nano akışlı ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UHPLC) sistemine bağlanır.
| MQ Parametre Ayarları (ver 1.6.2.10) | |||
| Ayar | Eylem | ||
| Konfigürasyon | |||
| Değişiklik | Met4 | Yeni değişiklik ekleyin. Kompozisyon'u H(-3) Hx(3) Cx C(-1) olarak ayarlayın ve özgüllük olarak M'yi seçin. | |
| Metil4 (KR) | "Metil (KR)" yi çoğaltın, yeniden adlandırın ve bileşimi Cx H (-1) Hx (3) olarak değiştirin | ||
| Dimetil4 (KR) | "Dimetil (KR)"yi çoğaltın, yeniden adlandırın ve bileşimi H(-2) Hx(6) Cx(2) olarak değiştirin | ||
| Trimetil4 (K) | "Trimetil (K)"yi çoğaltın, yeniden adlandırın ve bileşimi Cx(3) H(-3) Hx(9) olarak değiştirin | ||
| OxMet4 | "Oksidasyon (M)" yi çoğaltın ve yeniden adlandırın. | ||
| Proteases | Lisarginaz | Yeni proteaz ekleyin. 'R' ve 'K' sütunlarını seçin. | |
| Yeni bir PTM veya proteaz oluştururken, MaxQuant ayarlarını değiştirmek için "Tabloyu Değiştir" i ve ardından değişiklikleri onaylamak için "Değişiklikleri Kaydet" i tıklayın. MaxQuant'ı yeniden başlattığınızda yeni seçenekler görünür olacaktır. | |||
| Ham Dosyalar sekmesi | |||
| Parametreler grubu | Ham dosyaları 2 gruba ayırın (0 ve 1) | ||
| Gruba Özel Parametreler | |||
| Tür | Tür | Standart | |
| Multiplicity | 1 | ||
| Sindirim | Enzim | Tripsin veya Lysarginase | |
| Kaçırılan Bölünmeler | 3 olarak ayarlayın | ||
| Değişiklik | Değişken değişiklikleri | Grup 0 | Oksidasyon (M), Metil (KR), Dimetil (KR), Trimetil (K) |
| Grup 1 | OxMet4, Metil4 (KR), Dimetil4 (KR), Trimetil4 (K) | ||
| Sabit Değişiklikler | Grup 0 | Karbamidometilasyon | |
| Grup 1 | Karbamidometilasyon ve Met4 | ||
| Genel parametreler | |||
| Dizi | Fasta dosyaları | FASTA dosyasını yükle | |
| Kimlik | PSM FDR | 0,01 olarak ayarlayın | |
| Modifiye peptidler için Min. Skor | 1 olarak ayarlayın | ||
| Modifiye peptitler için min. Delta skoru | 1 olarak ayarlayın | ||
| Gelişmiş Tanımlama | İkinci peptit araştırması | Çıkış yapın | |
| Tablo | Tümünü yazPeptides tablosu | Çek | |
| İleri | Tepe özelliklerini hesaplama | Çek | |
| Belirtilmezse, varsayılan parametreyi olduğu gibi bırakın. | |||
| Kuruluş Testi için MQ Parametre Ayarları | |||
| Gruba Özel Parametreler | |||
| Tür | Tür | Standart | |
| Multiplicity | 2 | ||
| Max Etiketli | 5 | ||
| Ağır Etiket | Met4'ü seçin | ||
| Sindirim | Enzim | Tripsin veya Lysarginase | |
| Kaçırılan Bölünmeler | 3 olarak ayarlayın | ||
| Değişiklik | Değişken değişiklikleri | Oksidasyon (M) | |
| Sabit Değişiklikler | Karbamidometilasyon | ||
| Belirtilmezse, varsayılan parametreyi olduğu gibi bırakın. | |||
Tablo 3: MaxQuant işleme parametreleri. Açıklanan spesifik deneye göre ayarlanan gruba özgü ve global parametreler listelenir. Diğer tüm parametreler, kullanılan program sürümüne bağlı olarak varsayılan olarak ayarlanmıştır.
| Sütun adı | Tarif |
| Rawfile | Çiftin tanımlandığı ham veri dosyası |
| H-Tarama | Heavy muadilinin tarama numarası |
| L-Tarama | Işık karşılığının tarama numarası |
| .CLASS | 3 değere sahip olabilir: |
| Eşleşen = Ağır ve Hafif peptitler aynı sırayla tanımlanır | |
| Uyumsuz = Ağır ve hafif peptitler aynı aa dizisine sahiptir, ancak metillenmiş bölgenin lokalizasyonunda bir uyumsuzluk vardır. | |
| Kurtarıldı = Çiftte sadece bir peptid tanımlanmıştır; muadili tanımlanamayan bir zirvedir. | |
| PEPTİT | Peptit dizisi |
| PUAN | Peptit Andromeda Skoru |
| RES | Modifiye kalıntı |
| POS | Modifiye kalıntının konumu |
| MOD | Değişiklik |
| KURŞUN PROTEİN | Peptitin ait olduğu protein |
| GEN | Proteine karşılık gelen gen adı |
| PROBABILITY_TRUE | Çiftin lojistik regresyon modeli ile hesaplanan gerçek bir hmSILAC çifti olma olasılığı |
| TAHMİN | 1 eğer duble doğru ise, 0 yanlış ise |
| H/L LOGRATIO | Ağır/Hafif Yoğunluk oranının Log2'si |
| BENİ | Beklenen ve gözlemlenen kütle farkı arasındaki sapma |
| DRT (Serbest Dolaşım | Bekletme süresindeki fark |
Tablo 4: hmSEEKER çıktı sonuçları açıklaması. hmSEEKER çıktı tablosundaki sütun girişlerinin listesi, içeriklerinin kısa bir açıklamasıyla birlikte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Global MS bazlı proteomikler tarafından in vivo protein/peptit metilasyonunun yüksek güvenilirlikle tanımlanması, yüksek FDR riski nedeniyle, metilasyona izobarik olan ve ortogonal MS doğrulama stratejilerinin yokluğunda yanlış atamalara neden olabilen numune hazırlama sırasında meydana gelen çeşitli amino asit ikameleri ve metil-esterifikasyonu ile zordur. Bu PTM'nin substokiyometrik doğası, küresel metil-proteomiklerin görevini daha da karmaşıklaştırır, ancak modifiye peptidlerin seçici zenginleştirilmesiyle üstesinden gelinebilir10.
Burada, HpH-RP kromatografi peptid fraksiyonasyonu ve anti-pan-R-metil-peptidler antikor kitleri ile afinite zenginleştirme ile birleştirilmiş hmSILAC stratejisinin uygulanması yoluyla R-metil-peptidlerin küresel MS-analizinin verimliliğini ve güvenilirliğini artırmak için tasarlanmış biyokimyasal ve analitik bir iş akışı sunulmaktadır. İlk strateji, metil-peptitlerin ortogonal doğrulamasına izin verir ve tanımlamanın FDR'sini güçlü bir şekilde azaltırken, ikinci protokol, değiştirilmemiş peptitlerin arka planından tespit edilebilirliklerini arttırır22. Bununla birlikte, bu protokolün bir sınırlaması, sonraki peptid fraksiyonasyonu ve afinite zenginleştirmesi için girdi olarak çok büyük miktarda başlangıç proteini ekstraktının (20-40 mg aralığında) gerekliliğidir; bu, yöntemin uygulanmasını ölümsüzleştirilmiş, hızlı büyüyen hücre hatlarına sınırlar. Bunun yerine, mevcut kurulum hasta kaynaklı birincil hücrelere veya dokulara uygulanamaz. Gelecekteki araştırmalar, protokolü bu yönde geliştirmek için yönlendirilmelidir: metillenmiş peptidin değiştirilmemiş olanlara göre biyokimyasal zenginleştirilmesi için ek stratejiler, antikorların kullanımının aşılmasına izin verebilir ve deneylerin ölçeğinin küçültülmesini sağlayabilir. Bir başka ilginç gelişme, mevcut yöntemlerin, proteolitik peptitlerin izobarik veya tandem kütle etiketleri ile kimyasal modifikasyonu ile iki kat potansiyel avantajlarla birleştirilmesiyle temsil edilebilir: bir yandan, tek bir deneyde birden fazla koşulu birleştirme olasılığı, böylece metil-proteomik değişikliklerin farklı pertürbasyonlar üzerindeki nispi niceliğini çoğaltma; Öte yandan, kromatografik fraksiyonasyon ve afinite zenginleştirmeden önce farklı numunelerin bir araya getirilmesi, bireysel deneylerin ölçeğini azaltmaya izin verebilir.
Bu protokol, Tripsin ve LysargiNase ile paralel olarak tüm hücre ekstraktının iki ayrı sindirimine dayanır. Tripsin peptid bağını K ve R kalıntılarının C-terminal tarafında ayırır ve α-amin23'ten N-terminal pozitif yüküne ek olarak, C-terminusta pozitif yüklü bir kalıntı sunan peptitler üretir. LysargiNase enzimi, peptidil-K ve -R bağlarını seçici olarak hidrolize eder ve N-terminal bölgesinde K-metillenmiş formları içerebilen bir K veya R taşıyan peptitler üretir. Her iki proteazın kullanımı, büyük ölçekli MS-analizinde genel proteom kapsamını arttırır ve sonunda tek bir triptik sindirim18'de kaçırılan peptitlerin tanımlanmasına yol açar. Çift enzimatik sindirim, bunun yerine, olası kaçırılmış enzimatik bölünmelerin sayısını azaltmak için gerçekleştirilir. Aslında, K ve R'nin metilasyonu, tripsin ile protein bölünmesinin verimliliğini güçlü bir şekilde azaltır. Bu önlemin alınmasına rağmen, metillenmiş peptitlerin daha uzun olması ve zayıf CID parçalanmasına yol açan kaçırılmış bölünmeler içermesi hala yaygındır.
Elektron Transfer Ayrışması (ETD) gibi başka bir parçalanma türünün kullanılması bu sorunu çözebilir. Nitekim, ETD genellikle CID gibi iki kat yüklü peptid iyonlarını verimli bir şekilde parçalamaz, ancak daha yüksek yük durumlarının peptid öncüllerinin oldukça düzgün bölünmesini sağlar (≥3). Bu, R-metilasyon durumunda bir avantaj olabilir, çünkü sıklıkla çoklu ve komşu R kalıntıları içeren Arginin bakımından zengin alanlarda görülür. Bununla birlikte, ETD, CID'den daha düşük bir tarama oranına sahiptir, bu nedenle toplam peptid tanımlama sayısı 24,25,26 oranında azalır.
Son zamanlarda, translasyonel olarak modifiye edilmiş peptitlerin zenginleştirilmesini içeren birkaç protokol, peptid karışımının karmaşıklığını azaltmaya yardımcı olan ve böylece MS'te modifiye peptit tespitinin genel verimliliğini artıran farklı kromatografi ayırma stratejileri ile birleştirilmiştir. Burada, fraksiyonların bitişik olmayan birleşimi ile birlikte HpH-RP kromatografik fraksiyonasyonu uygulanır. Yüksek pH ters faz kromatografisine dayanan çevrimdışı peptit fraksiyonasyonu, LC-MS/MS çalıştırma27 sırasında aşağı yönde gerçekleştirilen on-line düşük pH RP-separasyonuna ortogonal olan yüksek çözünürlü bir güç ayrımı görüntüler. Dahası, bitişik olmayan birleştirme stratejisinin iki ana avantajı vardır: birincisi, erken, orta ve geç salınan fraksiyonları bireysel birleştirilmiş fraksiyonlara havuzlayarak protein kapsamını arttırır ve peptid karışımının heterojenliğini korur. İkincisi, birleştirme, daha az sayıda örnek fraksiyonu elde ederek sonraki MS çalışma zamanı analizini azaltır28.
R-metilasyonun substokiyometrik doğası nedeniyle, modifikasyon proteomlarının global MS-analizinde metil-peptitlerin tespitini kolaylaştırmak için bir zenginleştirme adımı gereklidir. Bu protokolde, metil-peptitler, anti-SDMA ve anti-ADMA antikorları paralel olarak kullanılarak immüno-afinite çökeltmesi (IAP) ile zenginleştirilirken, anti-MMA antikoru kullanan mono-metil-peptidlerin immüno-çökeltilmesi, önceki IAP deneylerinden FT'ler üzerinde gerçekleştirilir. Bu düzen, bu antikorların farklı verimliliğini yansıtır: anti-SDMA ve anti-ADMA antikorları, anti-MMA antikoruna kıyasla daha düşük bağlanma verimliliğine sahiptir. Kayda değer olarak, bu farklı verimlilik, deneysel olarak açıklamalı29 modifikasyon-proteomlarındaki farklı derecelerde R-metilasyonlarının temsilinde önyargılara da neden olabilir.
Anti-pan-R-metilasyon antikorlarının ticari mevcudiyeti öncesinde, MS tarafından R-metillenmiş peptid tespitini artırmak için güçlü katyon değişimi (SCX) ve hidrofilik etkileşim (HILIC) kromatografisi gibi diğer ayırma stratejileri uygulanmıştır. Bu teknikler MS'te analiz edilen peptid karışımının karmaşıklığını azaltabilse de, metil-peptitlerin30,31,32,33 tanımlanmasını önemli ölçüde iyileştirmemiştir.
Metil-peptit ayırma, algılama, parçalanma ve sekans ek açıklamasını arttırmayı amaçlayan tüm bu teknik ve analitik çözümlere rağmen, metil-proteom kapsamı hala sınırlıdır ve ribonükleoprotein, RNA bağlayıcı helikazlar gibi daha bol miktarda metillenmiş proteinlere karşı önyargılıdır, oysa bilinen birkaç düşük bol modifiye protein (örneğin, TP53BP1, CHTF8, MCM2) sadece tesadüfi olarak tespit edilir ve çoklu küresel deneylerde güvenilir bir şekilde tespit edilmez34 . Mevcut iş akışından önce uygulanan hücre altı fraksiyonasyon, bu tür proteinlerin tespitini iyileştirebilir; ancak, gerekli olan mevcut deneysel ölçek bunu uygulanabilir bir alternatif haline getirmemektedir.
MS üzerine, ham veriler peptid ve PTM tanımlaması için MaxQuant algoritması aracılığıyla analiz edilir. Bununla birlikte, hmSILAC deneylerinden elde edilen verilerin analizi, standart arama algoritmalarıyla basit değildir. Örneğin, MaxQuant, izotopik olarak kodlanmış K ve R ile metabolik etiketlemeye dayanan standart SILAC deneylerini verimli bir şekilde analiz edebilirken, izotop etiketleme, ağır metilasyona yol açan ağır metil etiketlemesinde olduğu gibi, değişken bir PTM'ye kodlandığında verimli bir şekilde çalışmaz. Bu nedenle, burada benimsenen strateji, hafif ve ağır peptitlerin bağımsız olarak tanımlanabilmesi için dahili çift arama işlevini kullanmadan hmSILAC verilerini MaxQuant ile analiz etmekten ibarettir; daha sonra bir işlem sonrası yazılımla eşleştirilirler. Bu biyoinformatik iş akışının da kendi tuzakları vardır, çünkü MaxQuant'ın Değişken Modifikasyonlar panelinde hem ağır hem de hafif formlarda metilasyonları belirtmek zorundadır, bu da Metiyonin oksidasyonu (ağır ve hafif) dahil edildiğinde toplam sekiz değişken modifikasyonla sonuçlanır. MaxQuant / Andromeda gibi bir veritabanı arama motoruyla çok fazla PTM aramak pratik değildir, çünkü algoritmanın test etmesi gereken teorik peptitlerin üstel bir artışına yol açar: çözümümüz, her MS ham verisini, farklı değişken PTM kümeleriyle (MaxQuant'ın parametre grupları işlevi aracılığıyla) iki kez analiz etmekti. Peptit aramasından sonra, MaxQuant tarafından üretilen çıktı tablolarından ağır-hafif peptid çiftlerinin atanmasını desteklemek için şirket içi geliştirilen hmSEEKER aracı kullanılır. hmSEEKER algoritmasının ilk sürümü yakın zamandayayınlandı 13, hmSEEKER'ın hmSILAC çiftlerini FDR <% 1 ile tanımlayabileceği gösterildi. Yanlış pozitifler, şans eseri 4.02 Da'nın katları kütle farkına sahip olan tepe çiftlerinden hala ortaya çıkabilir, ancak aşağıdaki gerçeklerin ışığında, Eşleşen veya Eşleşmemiş olarak sınıflandırılan çiftler için bu pek olası değildir: Eşleşen veya Eşleşmeyen bir çiftin yanlış olması için, Andromeda'nın hem ağır hem de hafif muadilinin sırasını yanlış belirlemesi gerekir. Arama motorunun varsayılan parametreleriyle çalıştırıldığını varsayarsak, her tanımlamanın yanlış olma olasılığı% 1'dir. Bu nedenle, hmSILAC muadilinin de yanlış olma olasılığı% 0.01'dir.
hmSILAC'ın bir tuzağı, omurgalarında Metiyonin içeren peptitlerin aynı zamanda metil-peptitler tarafından üretilenlerden ayırt edilemeyen çiftler oluşturmasıdır. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, bu önemli bir sorunu temsil etmemelidir, çünkü ilk önce metilasyonsuz peptitler MaxQuant çıktısından kolayca atılabilir ve ikincisi, hmSEEKER, beklenen kütle farkını hesaplarken bir metil-peptiddeki herhangi bir Metiyonin kalıntısını otomatik olarak hesaba kattığından; Son olarak, bu risk, ağır ve hafif modifikasyonların ayrı parametre gruplarında aranması gerçeğiyle de dışlanır, böylece arama motoru ağır bir mono-metilasyonu (+18.03 Da) hafif bir mono-metilasyona artı ağır bir Metiyonine (14.01 + 4.02 Da) bölemez.
Bu soruna daha resmi ve deneysel bir çözüm, Oreste Acuto ve işbirlikçileri tarafından, izometiyonin metil-SILAC (iMetil-SILAC)22 adlı bir hmSILAC varyantı geliştiren kişiler tarafından önerildi. Bu alternatif metabolik etiketleme protokolünde, doğal ışık Metiyonin, [13 CD 3]-Metiyonin (Met-4) ile aynı kütleye sahip olan [13C4]-Metiyonin ile değiştirilir, ancak moleküler etiket içindeki ağır izotopların farklı dağılımı nedeniyle kararlı izotopik olarak kodlanmış metil grupları üretmez. Bu nedenle, iMetil-SILAC deneylerinde, modifiye edilmemiş Metiyonin içeren peptitler çift üretmez. Bununla birlikte, Acuto ve iş arkadaşları iMetil-SILAC ve geleneksel hmSILAC'ın performansını karşılaştırdıklarında, iki yöntemin hala çok benzer FDR'ler sergilediği belirtilmelidir.
hmSEEKER'ın olası bir sınırlaması, doğrudan MaxQuant çıktı tablolarında çalışacak şekilde tasarlanmış olmasıdır, böylece kaynak kodu, çıktı dosyaları farklı şekilde yapılandırılmış diğer arama motorlarıyla uyumlu değildir; Bu anlamda, MethylQuant35, hmSILAC tipi deneylerden MS ham verilerinin doğrudan analizi için özel olarak uyarlanmış ve sağlanan giriş dosyaları açısından daha esnek olan iyi bir alternatif biyoinformatik araç sağlar. Kullanıcı tanımlı eşiklere güvenmeden doğru ve yanlış metil-peptit H / L çiftlerini ayırt etmek için bir makine öğrenme modeli geliştirilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
MM ve EM, Avrupa Moleküler Tıp Okulu (SEMM) bünyesindeki doktora öğrencileridir. EM, 3 yıllık FIRC-AIRC bursunun sahibidir (Proje Kodu: 22506). TB grubundaki R-metil-proteomların küresel analizleri AIRC IG Hibe (Proje Kodu: 21834) ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
References
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T.
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al.
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
