امتصاص الفلورسنت المسمى Vesicles صغيرة خارج الخلية في المختبر وفي الحبل الشوكي
Summary
نحن نصف بروتوكول لتسمية الحويصلات الصغيرة المشتقة من الضامة خارج الخلية مع أصباغ PKH ومراقبة امتصاصها في المختبر وفي الحبل الشوكي بعد الولادة داخل العين.
Abstract
الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) هي الحويصلات 50-150 نانومتر تفرزها جميع الخلايا ومتواجدة في سوائل الجسم. تقوم المركبات الذاتية بنقل الجزيئات الحيوية مثل الحمض النووي الريبي والبروتينات والدهون من المتبرعين إلى خلايا القبول، مما يجعلها وسطاء إشارات رئيسية بين الخلايا. في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، يمكن أن تتوسط أجهزة التلفاز للإشارات بين الخلايا، بما في ذلك التفاعلات العصبية المناعية. يمكن دراسة وظائف sEV عن طريق تتبع امتصاص sEVs المسمى في الخلايا المتلقية في المختبر وفي الجسم الحي. تصف هذه الورقة وضع العلامات على المركبات ذاتية الدفع من الوسائط المكيفة لخلايا الضامة RAW 264.7 باستخدام صبغة غشاء PKH. فإنه يظهر امتصاص تركيزات مختلفة من sEVs المسمى في نقاط زمنية متعددة من قبل خلايا Neuro-2a والخلايا الفلكية الأولية في المختبر. كما يظهر امتصاص sEVs تسليمها intrathecally في الخلايا العصبية الحبل الشوكي الماوس، والخلايا الفلكية، وmicroglia تصورها المجهر confocal. تظهر النتائج التمثيلية تباينا يعتمد على الوقت في امتصاص الخلايا المختلفة للمركبات الكهربائية المستقلة ، مما يمكن أن يساعد في تأكيد الولادة الناجحة للمركبات الكهربائية في الحبل الشوكي.
Introduction
الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) هي حويصلات نانوية مشتقة من الأغشية مع نطاق حجم يتراوح بين 50-150 نانومتر. أنها تنشأ من أجسام متعددة المركبات (MVBs) ويتم تحريرها من الخلايا عند دمج MVBs مع غشاء البلازما. تحتوي المركبات الذاتية على ميرناس، ورناس، وبروتينات، ودهون نشطة بيولوجيا، ويتم نقل هذه الجزيئات بين الخلايا في شكل اتصال من خلية إلى خلية. يمكن استيعابها بواسطة الخلايا المتلقية بواسطة مجموعة متنوعة من المسارات الانسطية، ويتم التوسط في التقاط هذه المركبات من قبل الخلايا المتلقية من خلال التعرف على جزيئات السطح على كل من المركبات الكهربائية والخلايا المستهدفة1.
اكتسبت sEVs الاهتمام بسبب قدرتها على إحداث تغييرات جزيئية وفينوطيبيك في الخلايا المقبولة ، وفائدتها كعامل علاجي ، وإمكاناتها كناقلين لجزيئات الشحن أو العوامل الدوائية. نظرا لصغر حجمها ، يمكن أن يكون تصوير وتتبع المركبات ذاتية الدفع تحديا ، خاصة بالنسبة للدراسات الحية والإعدادات السريرية. لذلك ، تم تطوير العديد من الطرق لتسمية وصور sEVs للمساعدة في التوزيع الحيوي وتتبع في المختبر وفي الجسم الحي2.
التقنية الأكثر شيوعا لدراسة التوزيع الحيوي SEV والتفاعلات الخلية المستهدفة ينطوي على وضع العلامات عليها مع جزيئات صبغ الفلورسنت3،4،5،6،7. وصفت المركبات الكهربائية في البداية مع الأصباغ غشاء الخلية التي كانت تستخدم عادة لتصوير الخلايا. هذه الأصباغ الفلورية وصمة عار عموما ثنائي الطبقة الدهون أو البروتينات ذات الفائدة على sEVs. العديد من الأصباغ lipophilic عرض إشارة الفلورسنت قوية عندما أدرجت في السيتوسول، بما في ذلك دير (1،1′-ديوكوتاديسيل-3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine يوديد), ديال (1, 1′-dioctadecyl-3, 3، 3′، 3′-tetramethyl إندوكاربواسيانين بيركلورات)، ودي دي دي (1، 1′-ديوكوتاديسيل-3، 3، 3′-tetramethyl إندوكاربواسيانين 4-chlorobenzenesulfonate الملح)8،9،10،11.
الأصباغ الدهنية الأخرى، مثل PKH67 و PKH26، لديها مجموعة رأس قطبية فلورية للغاية وذيل هيدروكربوني طويل يتداخل بسهولة في أي بنية دهون ويؤدي إلى احتباس صبغ طويل الأجل وفلورسنس مستقر12. يمكن للأصباغ PKH أيضا تسمية المركبات الكهربائية ، والتي تسمح بدراسة خصائص EV في الجسم الحي13. وقد استخدمت العديد من الأصباغ الأخرى لمراقبة exosomes باستخدام المجهر الفلوري وتدفق قياس الخلايا، بما في ذلك الأصباغ تسمية الدهون14 والأصباغ نفاذية الخلية مثل carboxyfluorescein diacetate succinimidyl استر (CFDA-SE)15،16 وكالسين أسيتوكسميثيل (AM) استر17.
وقد وفرت دراسات المحادثات المتقاطعة بوساطة SEV بين خلايا مختلفة في الجهاز العصبي المركزي رؤى هامة حول الإمراض من الأمراض العصبية والعصبية18. على سبيل المثال، يمكن أن SEVs من الخلايا العصبية نشر الببتيدات بيتا اميلويد والبروتينات تاو الفوسفورية والمساعدة في الإمراض من مرض الزهايمر19. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي المركبات الكهربائية المشتقة من الكريات الحمراء على كميات كبيرة من ألفا سينوكلين ويمكن أن تعبر حاجز الدم في الدماغ وتسهم في أمراض باركنسون20. قدرة SEVs لعبور الحواجز الفسيولوجية21 ونقل الجزيئات الحيوية لاستهداف الخلايا يجعلها أدوات مريحة لتقديم الأدوية العلاجية إلى CNS22.
تصور امتصاص SEV من قبل عدد لا يحصى من خلايا الجهاز العصبي المركزي في الحبل الشوكي ستمكن كل من الدراسات الميكانيكية وتقييم الفوائد العلاجية للمركبات ذاتية المنشأ تدار من مصادر خلوية مختلفة. تصف هذه الورقة منهجية تسمية المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة وصورة امتصاصها في المختبر وفي الجسم الحي في الحبل الشوكي القطني بواسطة الخلايا العصبية والخلايا الدقيقة والخلايا الفلكية لتأكيد تسليم SEV نوعيا عن طريق التصور.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، أظهرنا وضع العلامات على المركبات ذاتية الدفع بأصباغ PKH وتصور امتصاصها في الحبل الشوكي. تستخدم الأصباغ الفلورية PKH lipophilic على نطاق واسع لتسمية الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي والمجهر الفلوري3،5،6،12<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من خلال المنح المقدمة من المعاهد القومية للصحة NINDS R01NS102836 ووزارة الصحة في ولاية بنسلفانيا تعزيز البحوث العالمية الكومنولث (CURE) الممنوحة لسينا ك. أجيت. نشكر الدكتور برادلي ناش على القراءة النقدية للمخطوطة.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
