蛍光標識小細胞小胞の取り込み と 脊髄における
Summary
マクロファージ由来の小細胞外小胞にPKH色素を標識し、髄腔内送達後の インビトロ および脊髄での取り込みを観察するプロトコルについて述べています。
Abstract
小細胞外小胞(sEV)は、全ての細胞によって分泌され、体液中に存在する50〜150nmの小胞である。sEVは、RNA、タンパク質、脂質などの生体分子をドナーからアクセプター細胞に移し、細胞間の主要なシグナル伝達メディエーターを作ります。中枢神経系(CNS)では、sEVは神経免疫相互作用を含む細胞間シグナル伝達を媒介することができる。sEV機能は 、in vitro と in vivoの両方のレシピエント細胞におけるラベル付きSEVの取り込み追跡によって研究することができます。本論文では、PKH膜色素を用いたRAW 264.7マクロファージ細胞のコンディション媒体からのsEVの標識について説明する。これは、Neuro-2a細胞と一次アストロサイトによって複数の時点で標識されたSEVの異なる濃度の取り込み を示しています。また、共焦点顕微鏡で可視化されたマウス脊髄ニューロン、アストロサイト、およびミクログリアでの脳内に送達されたsEVの取り込みも示されている。代表的な結果は、異なる細胞によるsEvの取り込みにおける時間依存的な変動を示し、脊髄へのsEv送達の成功を確認するのに役立つ。
Introduction
小細胞外小胞(sEV)は、50〜150nmのサイズ範囲を有するナノサイズの膜由来小胞である。それらはマルチ・シツル体(MVB)に由来し、MVBと原形質膜の融合時に細胞から放出される。sEVは、miRNA、mRNA、タンパク質、および生理活性脂質を含み、これらの分子は細胞間で細胞間通信の形で伝達される。sEVは、さまざまなエンドサイトー経路によってレシピエント細胞によって内部化することができ、そしてこのレシピエント細胞によるsEVの捕捉は、EVと標的細胞の両方の表面分子の認識によって媒介される1。
sEVは、アクセプター細胞の分子および表現型の変化を引き起こす能力、治療剤としての有用性、および貨物分子または薬理学的薬剤のキャリアとしての可能性のために関心を集めています。そのサイズが小さいため、sEvのイメージングとトラッキングは、特に 生体内 研究や臨床現場では困難です。したがって 、vitro および in vivo2でのバイオディストリビューションと追跡を支援するために、多くの方法が開発され、sEVを画像化しています。
sEV生体分布と標的細胞相互作用を研究する最も一般的な技術は、蛍光色素分子3、4、5、6、7でそれらを標識することを含む。EVは、最初は細胞を画像化するために一般的に使用された細胞膜色素で標識されました。これらの蛍光色素は、一般に、sEv上の目的とする脂質二重層またはタンパク質を染色する。いくつかの親油性染料は、DiR(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′、3’テトラメチル酸トリカルボシアニンヨウ化物)、DiL(1、 1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3′,3’テトラメチル中カルボシアニン過塩素酸塩)およびDiD(1,1′ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドカルボシアニン4-クロロベンゼンスルホナテン酸塩)8,9,10,11.
PKH67やPKH26などの他の親油性染料は、蛍光性の高い極性ヘッド基と、任意の脂質構造に容易に補間し、長期の色素保持および安定な蛍光12をもたらす長い脂肪族炭化水素尾を有する。PKH色素はまた、VIVO13でEV特性の研究を可能にするEVにラベルを付けることができます。他の多くの色素は、脂質標識染料14およびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル(CFDA-SE)15、16およびカルセインアセトキシメチル(AM)エステル17のような細胞透過性染料を含む、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いてエキソソームを観察するために使用されてきた。
CNSにおける異なる細胞間のsEV媒介性クロストークの研究は、神経炎症性および神経変性疾患の病因に関する重要な洞察を提供した。例えば、ニューロンからのsEVは、β-アミロイドペプチドおよびリン酸化タウタンパク質を広め、アルツハイマー病19の病因を助けることができる。さらに、赤血球由来のEVは、大量のα-シヌクレインを含み、血液脳関門を越え、パーキンソン病変20に寄与する。sEVが生理学的障壁21 を横断し、生体分子を標的細胞に移す能力は、治療薬をCNS22に送達するための便利なツールとなる。
脊髄内の無数のCNS細胞によるsEV取り込みの視覚化は、様々な細胞源からの外因的に投与されたSEvの治療上の利点の評価と共に、機械学的研究を可能にする。本論文では、マクロファージ由来のsEvにラベルを付け、ニューロン、ミクログリア、アストロサイトによる腰椎脊髄における インビトロ および インビボで の取り込みを画像化し、可視化によるsEV送達を定性的に確認する方法論を説明する。
Protocol
注:すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って行われ、ドレクセル大学医学部の施設動物ケア&使用委員会によって承認されました。時限妊娠CD-1マウスは、アストロサイシン培養のために使用され、すべてのダムは含浸後15日後に受け取られた。12週齢のC57BL/6マウスを 生体内 取り込み実験に使用した。 1. RAW 264.7 マクロファージ細胞からのsEv?…
Representative Results
遠心分離を介してRAW 264.7コンディショムドメディアからsEvを分離した後、NTAを使用して精製されたSEVの濃度およびサイズ分布を決定しました。RAW 264.7由来のsEVの平均平均サイズは140nmであり、ピーク粒子サイズは121.8nmであり、光散乱測定における最も検出可能な粒子が50〜150nmのエキソソームまたはsEvのサイズ範囲内に収まっていることを確認した(図1A)。細胞外小胞2018(…
Discussion
このプロトコルでは、PKH色素によるsEVの標識と脊髄におけるそれらの取り込みの視覚化を示した。PKHの親油性蛍光色素は、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡による細胞の標識に広く用いられている3,5,6,12,24,25.比較的長い半減期と低い細胞…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH NINDS R01NS102836とペンシルベニア州保健省ユニバーサル研究強化(CURE)からの助成金によって支えられ、シーナ・K・アジットに授与されました。ブラッドリー・ナッシュ博士の原稿の批判的な読み取りに感謝します。
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
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Cite This Article
Gupta, R., Luo, X., Lin, Z., Tian, Y., Ajit, S. K. Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord. J. Vis. Exp. (171), e62537, doi:10.3791/62537 (2021).