Summary

ספיגת של שלל פלואורסצנטי שכותרתו שלשלות חוץ תאיות קטנות במבחנה ובחוט השדרה

Published: May 23, 2021
doi:

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לתיוג שלטי מקרופאג’ קטנים חוץ-תאיים עם צבעי PKH ומתבוננים בקליטתם במבחנה ובחוט השדרה לאחר הלידה התוך-תאית.

Abstract

שלל חוץ-תאי קטן (sEVs) הם שלל 50-150 ננומטר המופרש על ידי כל התאים ונוכח בנוזלי גוף. sEVs מעבירים ביומולקולים כגון RNA, חלבונים ושומנים מתורם לתאים מקבלים, מה שהופך אותם למתווכים מרכזיים בין תאים. במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), sEVs יכול לתווך איתות בין תאי, כולל אינטראקציות נוירואימוניות. פונקציות sEV ניתן ללמוד על ידי מעקב אחר ספיגת sEVs מסומן בתאי הנמען הן במבחנה והן ב- vivo. מאמר זה מתאר את התיוג של sEVs מהמדיה המותנית של תאי מקרופאגים RAW 264.7 באמצעות צבע קרום PKH. זה מראה את ספיגת ריכוזים שונים של sEVs מסומן בנקודות זמן מרובות על ידי תאי Neuro-2a אסטרוציטים ראשוניים במבחנה. כמו כן מוצגת ספיגת SEVs המועברת באופן תוך-רחמי בנוירונים של חוט השדרה של העכבר, אסטרוציטים ומיקרוגליה המודגמים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. התוצאות הייצוגיות מדגימות שונות תלוית זמן בספיגת ה- SEVs על ידי תאים שונים, אשר יכול לעזור לאשר מסירת SEVs מוצלחת לחוט השדרה.

Introduction

שלל חוץ-תאי קטן (sEVs) הם שלטי ננו-ממברנה שמקורם בממברנה עם טווח גודל של 50-150 ננומטר. מקורם בגופים רב-דרכים (MVBs) ומשוחררים מתאים עם היתוך ה-MVBs עם קרום הפלזמה. sEVs מכילים miRNAs, mRNAs, חלבונים, שומנים ביואקטיביים, ומולקולות אלה מועברות בין תאים בצורה של תקשורת בין תא לתא. sEVs יכול להיות מופנמ על ידי תאי הנמען על ידי מגוון של מסלולים אנדוציטיים, ו לכידה זו של sEVs על ידי תאי הנמען מתווכת על ידי זיהוי של מולקולות פני השטח הן על כלי עבודה והן על תאי היעד1.

sEVs צברו עניין בשל יכולתם לעורר שינויים מולקולריים ופנוטיפיים בתאים המקובלים, התועלת שלהם כסוכן טיפולי, ואת הפוטנציאל שלהם כמו נשאים עבור מולקולות מטען או סוכנים פרמקולוגיים. בשל גודלם הקטן, ההדמיה והמעקב אחר SEVs יכולים להיות מאתגרים, במיוחד עבור מחקרי vivo והגדרות קליניות. לכן, פותחו שיטות רבות לתיוג ותמונה sEVs כדי לסייע biodistribution ומעקב במבחנה ו in vivo2.

הטכניקה הנפוצה ביותר לחקר ייחוס ביולוגי של sEV ואינטראקציות בין תאי יעד כוללת תיוג אותם עם מולקולות צבע פלואורסצנטי3,4,5,6,7. EVs סומנו בתחילה עם צבעי קרום התא ששימשו בדרך כלל לתאי תמונה. צבעים פלואורסצנטיים אלה מכתימים בדרך כלל את דו-שכבתי השומנים או חלבונים מעניינים על SEVs. מספר צבעים ליפופיליים מציגים אות פלואורסצנטי חזק כאשר הם משולבים בציטוסול, כולל DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine יוד), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate), ו- DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine 4-כלורובצנסולפונט מלח)8,9,10,11.

צבעים ליפופיליים אחרים, כגון PKH67 ו- PKH26, יש קבוצת ראש קוטב פלואורסצנטית מאוד וזנב פחמימנים אליפטי ארוך כי בקלות intercalate לתוך כל מבנה שומנים ומוביל שימור צבע לטווח ארוך פלואורסצנטיותיציבה 12. צבעי PKH יכולים גם לתייג EVs, המאפשר את המחקר של תכונות EV ב vivo13. צבעים רבים אחרים שימשו לצפייה אקסוזומים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה, כולל צבעי תיוג שומנים14 וצבעים חדירים לתא כגון carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA-SE)15,16 ו קלצ’ין אצטטוקסימתיל (AM) אסתר17.

מחקרים של sEV בתיווך צולב בין תאים שונים במערכת ן סיפקו תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות נוירו-דליקות ונוירודגנרטיביות18. לדוגמה, SEVs מתאי עצב יכולים להפיץ פפטידים בטא עמילואיד וחלבוני טאו זרחן ולסייע בפתוגנזה של מחלתאלצהיימר 19. בנוסף, כלי עבודה אלקטרוניים הנגזרים אריתרוציטים מכילים כמויות גדולות של אלפא-סינוקלין ויכולים לחצות את מחסום הדם – מוח ולתרום לפתולוגיה של פרקינסון20. היכולת של SEVs לחצות מחסומים פיזיולוגיים21 ולהעביר biomolecules שלהם לתאי היעד עושה להם כלים נוחים כדי לספק תרופות טיפוליות ל- CNS22.

הדמיית ספיגת SEV על ידי תאי CNS רבים בחוט השדרה תאפשר הן מחקרים מכניים והן הערכת היתרונות הטיפוליים של SEV מנוהל אקסוגני ממקורות תאיים שונים. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לתייג SEVs הנגזר מקרופאגים ולדמיין את ספיגתם במבחנה וב- vivo בחוט השדרה המותני על ידי נוירונים, מיקרוגליה ואסטרוציטים כדי לאשר באופן איכותי את מסירת SEV על ידי הדמיה.

Protocol

הערה: כל ההליכים בוצעו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכללה לרפואה של אוניברסיטת דרקסל. עכברי CD-1 בהריון מתוזמן שימשו לתרבות אסטרוציטית, וכל הסכרים התקבלו 15 ימים לאחר הספגה. עכברי C57BL/6 בני 10-12 שבועות שימשו לניסויי ספיגת ויו…

Representative Results

לאחר בידוד של SEVs מ RAW 264.7 מדיה מותנית באמצעות צנטריפוגה, NTA שימש כדי לקבוע את הריכוז ואת התפלגות הגודל של SEVs מטוהר. הגודל הממוצע הממוצע של ה-RAW 264.7 sEVs נגזר היה 140 ננומטר, וגודל החלקיקים שיא היה 121.8 ננומטר, המאשר כי החלקיקים הניתנים לזיהוי ביותר במדידת פיזור האור נפלו בטווח הגודל של exosomes או sEVs ב 50-…

Discussion

בפרוטוקול זה, הראינו את התיוג של SEVs עם צבעי PKH ואת ההדמיה של ספיגתם בחוט השדרה. PKH צבעי פלואורסצנטית ליפופילית נמצאים בשימוש נרחב לתיוג תאים על ידי ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית3,5,6,12,24,<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ NIH NINDS R01NS102836 ואת מחלקת הבריאות של חבר העמים הבריטי אוניברסלי שיפור מחקר (CURE) הוענק Seena ק אג’יט. אנו מודים לד”ר בראדלי נאש על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

Materials

Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters MilliporeSigma Z677094
Anti-Alix Antibody Abcam ab186429 1:1000
Anti-Calnexin Antibody Abcam Ab10286 1:1000
Anti-CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-166029 1:1000
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) Cell Signaling Technology 2118 1:1000
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody Sigma-Aldrich MAB360 1:500 for IF; 1:1000 for IHC
Anti-Iba1 Antibody Wako 019-19741 1:2000
Anti-MAP2A Antibody Sigma-Aldrich MAB378 1:500
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 0332
Cell Strainer, 40 μm VWR 15-1040-1
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 3118-0050 12,000 x g
Coverslip, 12-mm, #1.5 Electron Microscopy Sciences 72230-01
Coverslip, 18-mm, #1.5 Electron Microscopy Sciences 72222-01
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG 1 µg/mL
DC Protein Assay Bio-Rad 500-0116
Deoxyribonuclease I (DNAse I) MilliporeSigma D4513-1VL
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) Abcam ab16284 1:10000
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-21206 1:500
Double Frosted Microscope Slides, #1 Thermo Scientific 12-552-5
DPBS without Calcium and Magnesium Corning 21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum Gibco A27208-01
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-011-CV
FluorChem M imaging system ProteinSimple
FV3000 Confocal Microscope Olympus
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) Abcam ab6789 1:10000
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11001 1:500
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 Invitrogen A-21125
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) VWR 02-0121
HEPES Gibco 15630080
HRP Substrate Thermo Scientific 34094
Intercept blocking buffer, TBS LI-COR Biosciences 927-60001
Laemmli SDS Sample Buffer Alfa Aesar AAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1 VWR 48404-454
Microm HM550 Thermo Scientific
NanoSight NS300 system Malvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 software Malvern Panalytical
Neuro-2a Cell Line ATCC CCL-131
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
O.C.T Compound Sakura Finetek 4583
Papain Worthington Biochemical Corporation NC9597281
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19210
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PKH26 Sigma-Aldrich MINI26-1KT
PKH67 Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 1862209
PVDF Transfer Membrane MDI SVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Cell Line ATCC TIB-71
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Sodium Chloride AMRESCO 0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold Slides Thermo Scientific 15-188-48 adhesive slides
T-75 Flasks Corning 431464U
Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope FEI Company
TEM Grids Electron Microscopy Sciences FSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12% Invitrogen XP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC26755
Tris-Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675
TrypLE Express cell dissociation enzyme
Triton X-100 Acros Organics 327371000
Trypsin, 0.25% Corning 25-053-CL
Tween 20
Ultracentrifuge Tubes Beckman 344058 110,000 x g

References

  1. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
  2. Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
  3. Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
  4. González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
  5. Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
  6. vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  7. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  8. Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
  9. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  10. Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
  11. Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
  12. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
  13. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  14. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  15. Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
  16. Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
  17. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  18. Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
  19. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
  20. Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
  21. Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
  22. Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  24. Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  25. Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
  26. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
  27. Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
  28. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
  29. Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
  30. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
  31. Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
  32. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  33. Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
  34. Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).

Play Video

Cite This Article
Gupta, R., Luo, X., Lin, Z., Tian, Y., Ajit, S. K. Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord. J. Vis. Exp. (171), e62537, doi:10.3791/62537 (2021).

View Video