Summary

Поглощение флуоресцентных меченых малых внеклеточных везикул in vitro и в спинном мозге

Published: May 23, 2021
doi:

Summary

Мы описываем протокол маркировки небольших внеклеточных везикул, полученных из макрофагов, красителями PKH и наблюдаем их поглощение in vitro и в спинном мозге после интратекальной доставки.

Abstract

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) представляют собой везикулы 50-150 нм, секретируемые всеми клетками и присутствующие в жидкостях организма. sEV переносят биомолекулы, такие как РНК, белки и липиды, от донорских к акцепторным клеткам, что делает их ключевыми сигнальными медиаторами между клетками. В центральной нервной системе (ЦНС) sEV могут опосредовать межклеточную сигнализацию, включая нейроиммунные взаимодействия. Функции sEV могут быть изучены путем отслеживания поглощения меченых sEV в клетках-реципиентах как in vitro, так и in vivo. В данной работе описывается маркировка sEV из кондиционированных сред клеток макрофагов RAW 264.7 с использованием мембранного красителя PKH. Он показывает поглощение различных концентраций меченых sEV в несколько временных точек клетками Neuro-2a и первичными астроцитами in vitro. Также показано поглощение sEV, доставляемых интратекально в нейроны спинного мозга мыши, астроциты и микроглию, визуализированные конфокальной микроскопией. Репрезентативные результаты демонстрируют зависящие от времени вариации в поглощении sEV различными клетками, что может помочь подтвердить успешную доставку sEV в спинной мозг.

Introduction

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) представляют собой наноразмерные, мембранные везикулы с диапазоном размеров 50-150 нм. Они происходят из многовезикулярных тел (MVB) и высвобождаются из клеток при слиянии MVB с плазматической мембраной. sEV содержат миРНК, мРНК, белки и биологически активные липиды, и эти молекулы переносятся между клетками в форме межклеточной связи. sEV могут быть интернализованы клетками-реципиентами различными эндоцитарными путями, и этот захват sEV клетками-реципиентами опосредован распознаванием поверхностных молекул как на EV, так и на клетках-мишенях1.

sEV приобрели интерес из-за их способности вызывать молекулярные и фенотипические изменения в акцепторных клетках, их полезности в качестве терапевтического агента и их потенциала в качестве носителей для грузовых молекул или фармакологических агентов. Из-за их небольшого размера визуализация и отслеживание sEV могут быть сложными, особенно для исследований in vivo и клинических условий. Поэтому было разработано много методов для маркировки и изображения sEV, чтобы помочь их биораспределению и отслеживанию in vitro и in vivo2.

Наиболее распространенный метод изучения биораспределения sEV и взаимодействия клеток-мишеней включает их маркировку флуоресцентными молекулами красителя3,4,5,6,7. Электромобили были первоначально помечены красителями клеточной мембраны, которые обычно использовались для изображения клеток. Эти флуоресцентные красители обычно окрашивают липидный бислой или белки, представляющие интерес на sEV. Несколько липофильных красителей демонстрируют сильный флуоресцентный сигнал при включении в цитозоль, включая DiR (1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндотрикарбоцианин йодид), DiL (1, 1′-диоктадецил-3, 3,3′, 3′-тетраметилиндокарбоцианинперхлорат) и DiD (1, 1′-диоктадецил-3, 3′, 3′-тетраметилиндокарбоцианин 4-хлорбензолсульфонатная соль)8,9,10,11.

Другие липофильные красители, такие как PKH67 и PKH26, имеют высокофлуоресцентную полярную головную группу и длинный алифатический углеводородный хвост, который легко интеркалируется в любую липидную структуру и приводит к долгосрочному удержанию красителя и стабильной флуоресценции12. Красители PKH также могут маркировать EV, что позволяет изучать свойства EV in vivo13. Многие другие красители были использованы для наблюдения экзосом с использованием флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, включая липидные красители14 и клеточно-проницаемые красители, такие как карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир (CFDA-SE)15,16 и кальцеин ацетоксиметил (AM) эфир17.

Исследования sEV-опосредованных перекрестных помех между различными клетками в ЦНС дали важную информацию о патогенезе нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний18. Например, sEV из нейронов могут распространять бета-амилоидные пептиды и фосфорилированные тау-белки и помогать в патогенезе болезни Альцгеймера19. Кроме того, EV, полученные из эритроцитов, содержат большое количество альфа-синуклеина и могут пересекать гематоэнцефалический барьер и способствовать патологии Паркинсона20. Способность sEV пересекать физиологические барьеры21 и переносить свои биомолекулы в клетки-мишени делает их удобными инструментами для доставки терапевтических препаратов в ЦНС22.

Визуализация поглощения сЭВ мириадами клеток ЦНС в спинном мозге позволит как механистические исследования, так и оценить терапевтические преимущества экзогенно вводимых sEV из различных клеточных источников. В данной работе описана методология маркировки sEV, полученных из макрофагов, и изображения их поглощения in vitro и in vivo в поясничном спинном мозге нейронами, микроглией и астроцитами для качественного подтверждения доставки sEV путем визуализации.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры были выполнены в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского колледжа Университета Дрекселя. Беременных мышей CD-1 использовали для астро?…

Representative Results

После выделения sEV из кондиционированных сред RAW 264.7 с помощью центрифугирования NTA использовали для определения концентрации и распределения по размерам очищенных sEV. Средний размер RAW 264.7-производных sEV составлял 140 нм, а пиковый размер частиц составлял 121,8 нм, подтверждая, что большинст…

Discussion

В этом протоколе мы показали маркировку sEV красителями PKH и визуализацию их поглощения в спинном мозге. Липофильные флуоресцентные красители PKH широко используются для маркировки клеток с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии3,5,</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантами NIH NINDS R01NS102836 и Департаментом здравоохранения Пенсильвании Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE), присужденными Сиене К. Аджит. Мы благодарим доктора Брэдли Нэша за критическое прочтение рукописи.

Materials

Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters MilliporeSigma Z677094
Anti-Alix Antibody Abcam ab186429 1:1000
Anti-Calnexin Antibody Abcam Ab10286 1:1000
Anti-CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-166029 1:1000
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) Cell Signaling Technology 2118 1:1000
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody Sigma-Aldrich MAB360 1:500 for IF; 1:1000 for IHC
Anti-Iba1 Antibody Wako 019-19741 1:2000
Anti-MAP2A Antibody Sigma-Aldrich MAB378 1:500
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 0332
Cell Strainer, 40 μm VWR 15-1040-1
Centrifuge Tubes Thermo Scientific 3118-0050 12,000 x g
Coverslip, 12-mm, #1.5 Electron Microscopy Sciences 72230-01
Coverslip, 18-mm, #1.5 Electron Microscopy Sciences 72222-01
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG 1 µg/mL
DC Protein Assay Bio-Rad 500-0116
Deoxyribonuclease I (DNAse I) MilliporeSigma D4513-1VL
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) Abcam ab16284 1:10000
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-21206 1:500
Double Frosted Microscope Slides, #1 Thermo Scientific 12-552-5
DPBS without Calcium and Magnesium Corning 21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum Gibco A27208-01
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-011-CV
FluorChem M imaging system ProteinSimple
FV3000 Confocal Microscope Olympus
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) Abcam ab6789 1:10000
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11001 1:500
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 Invitrogen A-21125
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) VWR 02-0121
HEPES Gibco 15630080
HRP Substrate Thermo Scientific 34094
Intercept blocking buffer, TBS LI-COR Biosciences 927-60001
Laemmli SDS Sample Buffer Alfa Aesar AAJ61337AC
Micro Cover Glass, #1 VWR 48404-454
Microm HM550 Thermo Scientific
NanoSight NS300 system Malvern Panalytical
NanoSight NTA 3.2 software Malvern Panalytical
Neuro-2a Cell Line ATCC CCL-131
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
O.C.T Compound Sakura Finetek 4583
Papain Worthington Biochemical Corporation NC9597281
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19210
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PKH26 Sigma-Aldrich MINI26-1KT
PKH67 Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 1862209
PVDF Transfer Membrane MDI SVFX8302XXXX101
RAW 267.4 Cell Line ATCC TIB-71
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Sodium Chloride AMRESCO 0241-2.5KG
Superfrost Plus Gold Slides Thermo Scientific 15-188-48 adhesive slides
T-75 Flasks Corning 431464U
Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope FEI Company
TEM Grids Electron Microscopy Sciences FSF300-cu
Tris-Glycine Protein Gel, 12% Invitrogen XP00120BOX
Tris-Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC26755
Tris-Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675
TrypLE Express cell dissociation enzyme
Triton X-100 Acros Organics 327371000
Trypsin, 0.25% Corning 25-053-CL
Tween 20
Ultracentrifuge Tubes Beckman 344058 110,000 x g

References

  1. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
  2. Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
  3. Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
  4. González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
  5. Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
  6. vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  7. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  8. Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
  9. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  10. Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
  11. Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
  12. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
  13. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  14. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  15. Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
  16. Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
  17. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  18. Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
  19. De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
  20. Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
  21. Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
  22. Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  24. Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  25. Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
  26. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
  27. Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
  28. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
  29. Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
  30. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
  31. Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
  32. Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
  33. Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
  34. Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).

Play Video

Cite This Article
Gupta, R., Luo, X., Lin, Z., Tian, Y., Ajit, S. K. Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord. J. Vis. Exp. (171), e62537, doi:10.3791/62537 (2021).

View Video