Aufnahme fluoreszierender markierter kleiner extrazellulärer Vesikel in vitro und im Rückenmark
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll, um aus Makrophagen gewonnene kleine extrazelluläre Vesikel mit PKH-Farbstoffen zu kennzeichnen und ihre Aufnahme in vitro und im Rückenmark nach intrathekaler Entbindung zu beobachten.
Abstract
Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind 50-150 nm Vesikel, die von allen Zellen abgesondert werden und in Körperflüssigkeiten vorhanden sind. sEVs übertragen Biomoleküle wie RNA, Proteine und Lipide von Donor- zu Akzeptorzellen und sind damit wichtige Signalvermittler zwischen Zellen. Im zentralen Nervensystem (ZNS) können sEVs interzelluläre Signalübertragungen vermitteln, einschließlich Neuroimmuninteraktionen. sEV-Funktionen können untersucht werden, indem die Aufnahme von markierten sEVs in Empfängerzellen sowohl in vitro als auch in vivoverfolgt wird. Dieser Artikel beschreibt die Markierung von sEVs aus den konditionierten Medien von RAW 264.7-Makrophagenzellen unter Verwendung eines PKH-Membranfarbstoffs. Es zeigt die Aufnahme unterschiedlicher Konzentrationen markierter sEVs zu mehreren Zeitpunkten durch Neuro-2a-Zellen und primäre Astrozyten in vitro. Ebenfalls gezeigt wird die Aufnahme von sEVs, die intrathekal in Rückenmarksneuronen, Astrozyten und Mikroglia der Maus abgegeben werden, die durch konfokale Mikroskopie visualisiert werden. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen zeitabhängige Variationen in der Aufnahme von sEVs durch verschiedene Zellen, was dazu beitragen kann, eine erfolgreiche sEVs-Abgabe in das Rückenmark zu bestätigen.
Introduction
Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind nanogroße, membranbasierte Vesikel mit einem Größenbereich von 50-150 nm. Sie stammen aus multi-vesikulären Körpern (MVBs) und werden bei der Fusion der MVBs mit der Plasmamembran aus Zellen freigesetzt. sEVs enthalten miRNAs, mRNAs, Proteine und bioaktive Lipide, und diese Moleküle werden in Form von Zell-zu-Zell-Kommunikation zwischen Zellen übertragen. sEVs können von Empfängerzellen durch eine Vielzahl von endozytischen Wegen internalisiert werden, und diese Erfassung von sEVs durch Empfängerzellen wird durch die Erkennung von Oberflächenmolekülen sowohl auf EVs als auch auf den Zielzellenvermittelt 1.
sEVs haben aufgrund ihrer Fähigkeit, molekulare und phänotypische Veränderungen in Akzeptorzellen auszulösen, ihres Nutzens als therapeutisches Mittel und ihres Potenzials als Träger für Frachtmoleküle oder pharmakologische Wirkstoffe an Interesse gewonnen. Aufgrund ihrer geringen Größe kann die Bildgebung und Verfolgung von sEVs eine Herausforderung darstellen, insbesondere für In-vivo-Studien und klinische Umgebungen. Daher wurden viele Methoden entwickelt, um sEVs zu kennzeichnen und abbilden, um ihre Bioverteilung und Verfolgung in vitro und in vivo2zu unterstützen.
Die gebräuchlichste Technik zur Untersuchung der sEV-Bioverteilung und der Wechselwirkungen mit Zielzellen bestehtdarin,sie mit fluoreszierenden Farbstoffmolekülen3,4,5,6,7zukennzeichnen. EVs wurden zunächst mit Zellmembranfarbstoffen markiert, die üblicherweise zur Abbildung von Zellen verwendet wurden. Diese fluoreszierenden Farbstoffe färben im Allgemeinen die Lipiddoppelschicht oder Proteine von Interesse auf sEVs. Mehrere lipophile Farbstoffe zeigen ein starkes fluoreszierendes Signal, wenn sie in das Zytosol eingebaut werden, darunter DiR (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyaniniodid), DiL (1 ,1′-Dioctadecyl-3, 3,3′, 3′-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat) und DiD (1 ,1′-Dioctadecyl-3, 3,3′,3′-Tetramethylindocarbocyanin-4-Chlorbenzolsulfonatsalz)8,9,10,11.
Andere lipophile Farbstoffe, wie PKH67 und PKH26, haben eine hoch fluoreszierende polare Kopfgruppe und einen langen aliphatischen Kohlenwasserstoffschwanz, der sich leicht in jede Lipidstruktur einfüg und zu einer langfristigen Farbstoffretention und stabilen Fluoreszenz führt12. PKH-Farbstoffe können auch EVs kennzeichnen, was die Untersuchung der EV-Eigenschaften in vivo13ermöglicht. Viele andere Farbstoffe wurden verwendet, um Exosomen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie zu beobachten, einschließlich Lipidmarkierungsfarbstoffe14 und zelldurchlässige Farbstoffe wie Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFDA-SE)15,16 und Calceinacetoxymethyl (AM)-Ester17.
Untersuchungen des sEV-vermittelten Crosstalks zwischen verschiedenen Zellen im ZNS haben wichtige Erkenntnisse über die Pathogenese neuroinflammatoratorischer und neurodegenerativer Erkrankungen geliefert18. Zum Beispiel können sEVs aus Neuronen Beta-Amyloid-Peptide und phosphorylierte Tau-Proteine verbreiten und bei der Pathogenese der Alzheimer-Krankheithelfen 19. Darüber hinaus enthalten EVs, die aus Erythrozyten gewonnen werden, große Mengen an Alpha-Synuclein und können die Blut-Hirn-Schranke überwinden und zur Parkinson-Pathologie beitragen20. Die Fähigkeit von sEVs, physiologische Barrieren21 zu überwinden und ihre Biomoleküle auf Zielzellen zu übertragen, macht sie zu bequemen Werkzeugen, um therapeutische Medikamente an das ZNS22zu liefern.
Die Visualisierung der sEV-Aufnahme durch unzählige ZNS-Zellen im Rückenmark ermöglicht sowohl mechanistische Studien als auch die Bewertung des therapeutischen Nutzens exogen verabreichter sEVs aus verschiedenen zellulären Quellen. Dieser Artikel beschreibt die Methodik zur Markierung von sEVs, die von Makrophagen abgeleitet sind, und zur Abbildung ihrer Aufnahme in vitro und in vivo im Lendenwirbelmark durch Neuronen, Mikroglia und Astrozyten, um die sEV-Abgabe durch Visualisierung qualitativ zu bestätigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll zeigten wir die Markierung von sEVs mit PKH-Farbstoffen und die Visualisierung ihrer Aufnahme im Rückenmark. PKH lipophile Fluoreszenzfarbstoffe werden häufig zur Markierung von Zellen durch Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie3,5,6,12,24,25verwendet. Aufgrund ihrer relativ langen Halbwertszei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse von NIH NINDS R01NS102836 und dem Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) unterstützt, die an Seena K. Ajit vergeben wurden. Wir danken Dr. Bradley Nash für die kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
