Vi beskriver ett protokoll för att märka macrophage-härledda små extracellulära vesiklar med PKH färgämnen och observera deras upptag in vitro och i ryggmärgen efter intratekal leverans.
Små extracellulära blåsor (sEVs) är 50-150 nm blåsor utsöndras av alla celler och finns i kroppsvätskor. sEVs överför biomolekyler som RNA, proteiner och lipider från givare till acceptorceller, vilket gör dem till viktiga signalmedlare mellan celler. I centrala nervsystemet (CNS) kan sEVs förmedla intercellulär signalering, inklusive neuroimmuna interaktioner. sEV-funktioner kan studeras genom att spåra användningen av märkta sEVs i mottagarceller både in vitro och in vivo. Detta dokument beskriver märkning av sEVs från konditionerade medier av RAW 264.7 makrofag celler med hjälp av en PKH membran färgämne. Det visar upptaget av olika koncentrationer av märkta sEVs vid flera tidpunkter av Neuro-2a celler och primära astrocyter in vitro. Också visas upptaget av sEVs levereras intratekalt i mus ryggmärg nervceller, astrocyter och microglia visualiseras av confocal mikroskopi. De representativa resultaten visar tidsberoende variation i upptaget av sEVs av olika celler, vilket kan bidra till att bekräfta framgångsrik sEVs leverans i ryggmärgen.
Små extracellulära blåsor (sEVs) är nanosized, membran-härledda blåsor med ett storleksintervall på 50-150 nm. De kommer från multi-vesicular organ (MVBs) och frigörs från celler vid fusion av MVBs med plasmamembranet. SEVs innehåller miRNAs, mRNAs, proteiner och bioaktiva lipider, och dessa molekyler överförs mellan celler i form av cell-till-cell kommunikation. SEVs kan internaliseras av mottagarceller genom en mängd olika endocytiska vägar, och denna fångst av sEVs av mottagarceller förmedlas genom igenkänning av ytmolekyler på både EVs ochmålcellerna 1.
sEVs har fått intresse på grund av deras förmåga att utlösa molekylära och fenotypiska förändringar i acceptorceller, deras användbarhet som terapeutiskt medel och deras potential som bärare för lastmolekyler eller farmakologiska medel. På grund av deras lilla storlek kan avbildning och spårning av sEVs vara utmanande, särskilt för in vivo-studier och kliniska inställningar. Därför har många metoder utvecklats för att märka och avbilda sEVs för att hjälpa deras biodistribution och spårning in vitro och in vivo2.
Den vanligaste tekniken för att studera sEV biodistribution och mål cell interaktioner innebär att märka dem med fluorescerande färgämnenmolekyler 3,4,5,6,7. EVs var ursprungligen märkta med cellmembranfärger som ofta användes för att avbilda celler. Dessa fluorescerande färgämnen färgar i allmänhet lipid gallayer eller proteiner av intresse på sEVs. Flera lipofila färgämnen uppvisar en stark fluorescerande signal när de ingår i cytosolen, inklusive DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyaninjodid), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametyl indokarbocyaninperklorat) och DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametyl indokarbocyanin 4-klorobenzenesulfonatsalt)8,9,10,11.
Andra lipofila färgämnen, såsom PKH67 och PKH26, har en mycket fluorescerande polarhuvudgrupp och en lång alifatisk kolvätesvans som lätt intercalates i någon lipidstruktur och leder till långsiktig färgretention och stabil fluorescens12. PKH-färgämnen kan också märka EVs, vilket gör det möjligt att studera EV-egenskaper in vivo13. Många andra färgämnen har använts för att observera exosomer med fluorescensmikroskopi och flödescytometri, inklusive lipidmärkningsfärgämnen14 och cellgenomsläppliga färgämnen som karboxyfluoresceindiaktat succinimidylester (CFDA-SE)15,16 och calcein acetoxymethyl (AM) ester17.
Studier av sEV-medierad crosstalk mellan olika celler i CNS har gett viktiga insikter om patogenesen vid neuroinflammatoriska och neurodegenerativa sjukdomar18. Till exempel kan sEVs från nervceller sprida beta-amyloidpeptider och fosforylerade tau-proteiner och hjälpa till med patogenesen vid Alzheimers sjukdom19. Dessutom innehåller EVs som härrör från erytrocyter stora mängder alfa-synuklein och kan korsa blod – hjärnbarriären och bidra till Parkinsons patologi20. SEVs förmåga att korsa fysiologiskahinder 21 och överföra sina biomolekyler till målceller gör dem till praktiska verktyg för att leverera terapeutiska läkemedel till CNS22.
Visualisera sEV upptag av otaliga CNS celler i ryggmärgen kommer att möjliggöra både mekanistiska studier och utvärdering av de terapeutiska fördelarna med exogent administrerade sEVs från olika cellulära källor. Detta dokument beskriver metoden att märka sEVs härrör från makrofager och avbilda deras upptag in vitro och in vivo i ländryggen ryggmärgen av nervceller, microglia och astrocyter att kvalitativt bekräfta sEV leverans genom visualisering.
I detta protokoll visade vi märkning av sEVs med PKH färgämnen och visualisering av deras upptag i ryggmärgen. PKH lipofila fluorescerande färgämnen används ofta för att märka celler efter flödescytometri och fluorescerande mikroskopi3,5,6,12,24,25. På grund av deras relativt långa halveringstid och låga cytotoxi…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av bidrag från NIH NINDS R01NS102836 och Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) som tilldelats Seena K. Ajit. Vi tackar dr Bradley Nash för kritisk läsning av manuskriptet.
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
Tween 20 | |||
Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |