Visualisation longitudinale stabilisée au niveau cellulaire in vivo du pancréas dans un modèle murin avec une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique
Summary
L’imagerie in vivo à haute résolution du pancréas a été facilitée par la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique.
Abstract
L’imagerie directe in vivo à résolution cellulaire du pancréas dans un modèle vivant de petit animal a été techniquement difficile. Une étude récente d’imagerie intravitale, avec une fenêtre d’imagerie abdominale, a permis de visualiser la dynamique cellulaire dans les organes abdominaux in vivo. Cependant, en raison de l’architecture molle en forme de feuille du pancréas de la souris qui peut être facilement influencée par le mouvement physiologique (par exemple, le péristaltisme et la respiration), il était difficile d’effectuer une imagerie longitudinale in vivo stabilisée sur plusieurs semaines au niveau cellulaire pour identifier, suivre et quantifier les îlots ou les cellules cancéreuses dans le pancréas de la souris. Nous décrivons ici une méthode d’implantation d’une nouvelle base de support, une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée, qui peut séparer spatialement le pancréas de l’intestin pour l’imagerie intravitale longitudinale time-lapse de la microstructure du pancréas. L’imagerie longitudinale in vivo avec la fenêtre d’imagerie permet une visualisation stable, permettant le suivi des îlots sur une période de 3 semaines et l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution de la microstructure, comme en témoigne ici un modèle orthotopique de cancer du pancréas. Avec notre méthode, d’autres études d’imagerie intravitale peuvent élucider la physiopathologie de diverses maladies impliquant le pancréas au niveau cellulaire.
Introduction
Le pancréas est un organe abdominal avec une fonction exocrine dans le tube digestif et une fonction endocrinienne de sécrétion d’hormones dans la circulation sanguine. L’imagerie cellulaire à haute résolution du pancréas pourrait révéler la physiopathologie de diverses maladies impliquant le pancréas, y compris la pancréatite, le cancer du pancréas et le diabète sucré1. Les outils d’imagerie diagnostique conventionnels tels que la tomodensitométrie, l’imagerie à résolution magnétique et l’échographie sont largement disponibles dans le domaine clinique1,2. Cependant, ces modalités d’imagerie se limitent à visualiser uniquement les changements structurels ou anatomiques, tandis que les altérations au niveau cellulaire ou moléculaire ne peuvent pas être déterminées. Étant donné que les changements moléculaires dans le diabète sucré ou le cancer du pancréas chez l’homme peuvent commencer plus de 10 ans avant le diagnostic3,4, la détection des maladies du pancréas à partir de leur transition moléculaire pendant la période de latence a le potentiel de fournir un diagnostic précoce et une intervention rapide. Ainsi, l’imagerie qui surmontera les limites de la résolution et fournira des informations précieuses sur la fonction attirera remarquablement l’attention en fournissant un diagnostic précoce du cancer du pancréas ou une identification avancée de l’altération des îlots au cours de la progression du diabète sucré5.
En particulier avec les îlots, l’imagerie nucléaire, l’imagerie par bioluminescence et la tomographie par cohérence optique ont été suggérées comme techniques d’imagerie non invasive des îlots6. Cependant, la résolution de ces méthodes est considérablement faible, avec des valeurs typiques allant de plusieurs dizaines à des centaines de micromètres, offrant une capacité limitée à détecter les changements au niveau cellulaire dans les îlots. D’autre part, des études antérieures à haute résolution sur les îlots ont été réalisées dans des conditions ex vivo7,8 (par exemple, tranchage ou digestion du pancréas), non physiologiques9 (par exemple, extériorisation du pancréas) et hétérotopiques10,11,12 (par exemple, implantation sous la capsule rénale, à l’intérieur du foie et dans la chambre antérieure de l’œil), ce qui limite leur interprétation et leurs implications cliniques. Si un modèle in vivo,physiologique et orthotopique d’imagerie à haute résolution peut être établi, ce sera une plate-forme critique pour l’étude des îlots pancréatiques.
L’imagerie intravitale, qui révèle la physiopathologie à un niveau de résolution microscopique chez un animal vivant, a récemment fait l’objet d’une grande attention13. Parmi les méthodes d’imagerie in vivo, le développement d’une fenêtre d’imagerie abdominale14,qui implante une fenêtre dans l’abdomen d’une souris, a permis de découvrir de nouvelles découvertes (c’est-à-dire un stade pré-micrométastase de la métastase hépatique précoce15 et un mécanisme de maintien des cellules souches dans l’épithélium intestinal16). Bien que la fenêtre d’imagerie abdominale fournisse des résultats précieux, les applications de cette fenêtre pour le pancréas et la recherche d’imagerie intravitale qui en résulte basée sur les maladies impliquant le pancréas n’ont pas été étudiées de manière approfondie.
Contrairement aux caractéristiques bien définies des organes solides du pancréas humain, le pancréas d’une souris est une structure semblable à des tissus mous distribués de manière diffuse17. Par conséquent, il est sans cesse affecté par les mouvements physiologiques, y compris le péristaltisme et la respiration. Une étude antérieure sur l’application d’une fenêtre d’imagerie abdominale pour le pancréas a démontré que l’errance se produisait en raison d’artefacts de mouvement induits par les selles18. Un flou sévère a été observé dans l’image moyenne résultante, ce qui a entravé la visualisation et l’identification des structures à l’échelle microscopique.
Ici, nous décrivons l’utilisation d’une nouvelle fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de soutien combinée à la microscopie intravitale19,20 pour étudier les événements au niveau cellulaire longitudinal dans les maladies impliquant le pancréas. En plus d’une description détaillée de la méthodologie de l’étude précédente18, l’application étendue de la fenêtre d’imagerie pancréatique pour diverses maladies impliquant le pancréas sera abordée dans cet article. Dans ce protocole, un système de microscopie confocale à balayage laser à débit vidéo sur mesure a été utilisé comme système de microscopie intravitale. Quatre modules laser (longueurs d’onde à 405, 488, 561 et 640 nm) ont été utilisés comme source d’excitation, et quatre canaux de signaux d’émission ont été détectés par des tubes photomultiplicateurs (PMT) à travers des filtres passe-bande (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Le balayage laser se composait d’un miroir polygonal rotatif (axe X) et d’un miroir à balayage galvanométrique (axe Y) qui permettait le balayage à débit vidéo (30 images par seconde). Des informations détaillées sur la microscopie intravitale ont été décrites dans les études précédentes10,18,19,20,21,22,23.
Dans notre étude précédente sur les îlots18,nous avons imagé avec succès et de manière stable les îlots chez des souris vivantes à l’aide d’un modèle murin transgénique (MIP-GFP)24 dans lequel les îlots ont été marqués avec GFP. La méthode a permis une visualisation haute résolution des changements dans les îlots sur une période de 1 semaine. Il a également facilité l’imagerie des mêmes îlots jusqu’à 3 semaines, ce qui suggère la faisabilité d’études à long terme des îlots pancréatiques pour le suivi fonctionnel ou la surveillance pendant la pathogenèse du diabète sucré18. De plus, nous avons développé un modèle de cancer du pancréas orthotopique dans lequel des cellules fluorescentes cancéreuses du pancréas (PANC-1 NucLight Red)25 ont été directement implantées dans le pancréas de la souris. Avec l’application de la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique, ce modèle pourrait être utilisé comme plate-forme pour étudier la physiopathologie cellulaire et moléculaire dans le microenvironnement tumoral du cancer du pancréas et pour la surveillance thérapeutique de nouveaux candidats médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici consiste en une imagerie intravitale du pancréas à l’aide d’une nouvelle fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique intégrée à la base de support modifiée à partir d’une fenêtre d’imagerie abdominale. Parmi les protocoles décrits ci-dessus, la première étape critique est l’implantation de la fenêtre d’imagerie pancréatique intravitale chez la souris. Pour l’application de la colle dans la fenêtre, il est important d’appliquer la colle entre la marge de la fenêt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par la subvention n ° 14-2020-002 du Fonds de recherche SNUBH et par la subvention de la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window – custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder – custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
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