En model af eksperimentel Steatosis In Vitro:Hepatocyt Cell Kultur i Lipid Overbelastning-Conditioned Medium

Summary

Denne protokol er beregnet til at være et værktøj til at studere steatose og molekylær, biokemiske, cellulære ændringer produceret af overeksponering af hepatocytter til lipider in vitro.

Abstract

Metabolisk dysfunktion-associeret fedtlever sygdom (MAFLD), tidligere kendt som ikke-alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD), er den mest udbredte leversygdom på verdensplan på grund af sin sammenhæng med fedme, diabetes type 2, og dyslipidæmi. Lever steatose, ophobning af lipid dråber i leveren parenkym, er et centralt element i sygdommen forud for betændelse observeret i steatohepatitis, fibrose, og slutstadiet leversygdom. Lipid ophobning i hepatocytter kan forstyrre korrekt metabolisme af xenobiotika og endogene molekyler, samt at fremkalde cellulære processer, der fører til fremme af sygdommen. Selvom den eksperimentelle undersøgelse af steatose kan udføres in vivo, er in vitro-tilgange til studiet af steatose komplementære værktøjer med forskellige fordele. Hepatocyt kultur i lipid overbelastning-betinget medium er en glimrende reproducerbar mulighed for studiet af lever steatose tillader identifikation af cellulære processer relateret til lipid ophobning, såsom oxidative og retikulære belastninger, autofagi, spredning, celledød, etcetera, samt andre test, herunder lægemiddeleffektivitet, og toksikologiske test, blandt mange andre mulige anvendelser. Her var det formålet at beskrive metoden for hepatocyt cellekultur i lipid overbelastning-betinget medium. HepG2 celler blev dyrket i RMPI 1640 medium konditioneret med natrium palmitat og natrium oleat. Vigtigere, forholdet mellem disse to lipider er afgørende for at favorisere lipid dråbe ophobning, samtidig med at cellespredning og en moderat dødelighed, som opstår i leveren under sygdommen. Metoden, fra udarbejdelsen af lipidopløsningslagrene, blandingen, tilføjelsen til mediet og hepatocytkulturen vises. Med denne tilgang, er det muligt at identificere lipid dråber i hepatocytter, der er let observerbare af olie-rød O farvning, samt kurver af spredning / dødelighed.

Introduction

Fedtlever forbundet med metabolisk dysfunktion er meget udbredt på verdensplan^1,2; Det anslås , at op til 25 % af befolkningen er berørt^{af 3}. Denne sygdom, der tidligere var kendt som ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD), har opdateret sin nomenklatur til metabolisk dysfunktion associeret fedtleversygdom (MAFLD) for nøjagtigt at afspejle patogenesen relateret til fedme, insulinresistens, diabetes type 2 og dyslipidæmi samt de mulige styringer af sygdommen^3,4.

Uanset navnet omfatter sygdommen et bredt spektrum af histopatologiske ændringer karakteriseret ved unormalt høj ophobning af lipider i leveren (>5% fedt i hepatocytterne⁵) og kan udvikle sig gennem lipidakkumuleringen, der typisk findes i simpel steatose til steatohepatitis, hvilket igen kan føre til udvikling af fibrose, skrumpelever, hepatocellulært karcinom og leversvigt^5,6,7,8. På grund af den stigende udbredelse forventes MAFLD at blive den første indikation af levertransplantation og den hyppigste årsag til hepatocellulært karcinom⁹.

Selv om det er blevet betragtet som en godartet eller mild form for fedtlever sygdom, lever steatose er i virkeligheden den metaboliske nøgle i MAFLD¹⁰. Forskellige metaboliske veje påvirkes af lipidakkumulering i leveren, herunder men ikke begrænset til lipidsyntese, eksport og metabolisme¹⁰. Insulinresistens, oxidativ stress, retikulær stress og cellulær dysfunktion er stærkt forbundet med lever lipotoxicitet^11,12. På den anden side er fede hepatocytter målet for reaktive iltarter, hvilket gør metabolitter som lipidperoxider, proteincarbonyller og adducts af nukleinsyrer¹³. På celleniveau kan fede hepatocytter gennemgå mitokondrieskader¹⁴, cellulær senescence^15,apoptose¹⁶, pyroptose¹²og autofagi¹⁷, blandt andre begivenheder.

Hepatocytter er meget ansvarlige for metabolisme, afgiftning og syntese af en bred vifte af molekyler. Mange af disse funktioner kan blive kompromitteret af lipid ophobning observeret i steatose. Derfor er det af stor betydning at have reproducerbare værktøjer, der muliggør en nøjagtig evaluering af steatose. I denne forstand er in vitro-modeller let anvendelige og meget reproducerbare. Steatosis in vitro er blevet brugt med forskellige mål^16,18,19. HepG2-cellerne er meget udbredt som hepatocytcellelinje. Det har fordele som at være let at kultur og godt karakteriseret. Måske er den eneste ulempe ved HepG2-celler det faktum, at det er en kræftfremkaldende cellelinje, så dette skal overvejes, når man analyserer resultaterne. Her vises anvendelsen af en blanding af fedtsyrer, der i vid udstrækning anvendes i cellekulturen: palmitic syre (PA) og oliesyre (OA). Både PA og OA tilbyder forskellige resultater i kultur²⁰. PA (C 16:0) er den mest almindelige mættede fedtsyrer fremstillet af kosten¹⁶. PA betragtes som en biomarkør for de-novo lipogenese, et afgørende skridt i udviklingen af NAFLD²¹. Pa har vist sig at være meget^{giftigt 22}; Derfor kan det ikke anbefales at fremkalde steatose in vitro. OA (C 18:1) er en enkeltumættet fedtsyre. I modsætning til PA, OA er blevet foreslået at besidde anti-inflammatoriske og anti-oxidant egenskaber, at være i stand til at modvirke PA¹². Både PA og OA er de vigtigste fedtsyrer, der findes i triglycerider, uanset tilstanden af sundhed eller sygdom¹⁶. Tabel 1 indeholder eksempler på hepatocytkulturen med PA, OA og deres blanding samt de rapporterede resultater^{12,23,24,25,26,27}. Andre fedtsyrer er også blevet anvendt i hepatocytkultur, herunder stearinsyre (C 18:0)^28,29,30, linolsyre (C 18:1)^28,30,31 og dens konjugates (CLA)^28,32, palmitolesyre (C 16:1)²⁹. Men deres anvendelse er mindst hyppigt rapporteret i litteraturen, måske fordi deres lever overflod er lavere end PA og OA¹⁶.

I forbindelse ligner begge fedtsyrer steatose in vitro, hvilket giver spredte celler med øget celledød og lavere levedygtighed sammenlignet med kontrolbetingelser. Det er værd at nævne, at de respektive salte af disse fedtsyrer er tilgængelige og kan også bruges. Et af de største problemer ved vurderingen af lipid overbelastning i hepatocyt cellekultur er givet i differentiering mellem toksikologiske modeller og en model, der bedst repræsenterer steatose. Mange modeller kan redegøres i det første tilfælde. Faktisk kan brugen af PA alene betragtes blandt dem, og den høje dødelighed er det mest tydelige resultat^{12,16,23,24,25,26,27}. Brugen af høje doser selv i tilfælde af OA kan også betragtes som en toksikologisk model. Protokollen vist her er i højere overensstemmelse med steatose udvikling, da det viser lav dødelighed i forhold til den, der observeres i andre modeller og gør det muligt at blive fulgt i løbet af flere dage med progressiv lipid ophobning, som det sker i NAFLD. Muligheden for at vurdere mild og svær steatose gennem eksperimentelle tilstande betragtes som en anden fordel.

Fedtsyrer	Kår		Resultater		Henvisning
PA	Koncentration: 200 μM		Lipid ophobning		Yan et al, 201925.
	Tidseksponering: 24 timer		Hepatocyte skader
			Transaminaser elevation
PA	Koncentration: 50, 100 og 200 μM		Lipid ophobning		Xing et al, 201924.
	Tidseksponering: 24 timer
PA	Koncentration: 250 μM , 500 μM , 750 μM og 1.000 μM		Lipid ophobning		Wang et al, 202026.
	Tidseksponering: 24 timer		Gradvis reduktion af celle levedygtighed
Blanding af OA/PA	Koncentration: 1 mM		Lipid ophobning		Xiao et al, 202027.
	Tidseksponering: 24 timer		Rapporterer ikke lipotoxicitet
	Pris: 2OA:1PA
Blanding af OA/PA	Først stimulering med 200 μM og 400 μM PA og derefter anden stimulering med 200 μM OA		Lipid ophobning.		Zeng et al, 202012.
	Koncentration:400 μM PA: 200 μM OA		Tegn på lipotoxicitet forårsaget af PA blev reduceret ved stimulering af OA.
	Pris: 2PA:1OA
	Tidseksponering: 24 timer
Blanding af OA/PA	Koncentration: 400 μM PA: 200 μM OA		Lipid ophobning		Chen et al, 201823.
	Pris: 2PA:1OA
	Tidseksponering: 24 timer
Blanding af OA/PA	Koncentration :50 og 500 μM		Generering af to typer steatose: mild steatose og alvorlig steatose.		Campos og Guzmán 2021
	Pris: 2PA:1OA		Simulerer kronisk redegørelse for lipid overbelastning
	Tidseksponering: 24 timer, 2 dage, 3 dage og 4 dage.

Tabel 1. Hepatocyt kultur i steatogenic betingelser. Tabellen præsenterer den type fedtsyre, der anvendes, de betingelser, der opretholdes, og de observerede resultater i hepatocyt kultur. PA: Palmitic syre. OA: Oliesyre.

Endelig gælder denne model ikke kun for studiet af steatose og fedtlever, men også for hepatiske metaboliske, syntetiske og afgiftning veje i forbindelse med steatose. Også, in vitro induceret steatose kan give dokumentation for identifikation af potentielle markører for sygdommen samt terapeutiske mål.

Protocol

1. Standard og konditioneret medium forberedelse For at forberede standard RPMI 1640 skal du supplere RPMI 1640-kulturmediet med 10 % (v/v) fosterkvægserum (FBS, tidligere varmeinaktiveret) og 1 % (v/v) penicillin-Streptomycin-opløsning. Mediet opbevares ved 4 °C.Steriliser ved hjælp af 0,22 μm filtre. For at forberede palmitat lageropløsning, forberede en 50 mM opløsning af palmitat i standard RPMI 1640 tidligere suppleret med 1% af kvæg serum albumin (lipid fri). Et volumen på 5-10 mL af de…

Representative Results

Hepatocytter, der dyrkes i det steatogene medium, viser vækst over hele brøndens overflade; imidlertid viser fede hepatocytter lavere vækstrate sammenlignet med celler, der dyrkes i kontrolmediet. Det foreslåede forhold og koncentrationen af OA og PA garanterer celleoverlevelse under kultur. Såning 1 x 105 celler pr. brønd i 24-brønds plader giver optimal sammenløb som vist i figur 1. Levedygtigheden i kultiverede celler var lavere i de steatoge…

Discussion

Denne protokol har til formål at give en strategi til undersøgelse af steatose in vitro. Cellekultur er et kraftfuldt værktøj til at studere cellulære, molekylære, biokemiske og toksikologiske aspekter af de celler, der udsættes for forskellige forhold. Med denne tilgang kan steatose visualiseres ikke kun som et stadium af den komplekse sygdom, der er MAFLD, men også som hepatocyt overeksponering for lipider og de mulige resultater som følge af en sådan eksponering. Derfor er dens anvendelse ikke begr?…

Materials

Biosafety cabinet	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filter	Corning, US	430513	Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801	–
Hemocytometer	Marienfeld, DE	640010	–
HepG2 cell line	ATCC, US	HB-8065	Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubator	Thermo Electronic Corporation,US	Model: 3110	Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope Eclipse	NIKON, JPN	Model: TE2000-S	–
Isopropanol	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L	–
Oil Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit for histological visualization of neutral fat.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G	–
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meter	Beckman, US	Model: 360 PH/Temp/MV Meter	–
Phosphate buffered saline	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023	–
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1254.001	Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Preparation of culture media
Sodium oleate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A	–
Sodium palmitate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881	–
Syring filter	Corning, US	431219	Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G	–
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM	Corning, US	25-052-Cl	–
24 well cell culture cluster	Corning, US	3524	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture cluster	Corning, US	3599	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.