Um modelo de esteatose experimental in vitro: cultura celular hepatocitada em meio lipídidamente condicionado

Summary

Este protocolo pretende ser uma ferramenta para estudar a esteatose e as alterações moleculares, bioquímicas, celulares produzidas pela exposição excessiva de hepatócitos a lipídios in vitro.

Abstract

A doença hepática gordurosa associada à disfunção metabólica (MAFLD), anteriormente conhecida como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), é a doença hepática mais prevalente em todo o mundo devido à sua relação com obesidade, diabetes tipo 2 e dislipidemia. Esteatose hepática, o acúmulo de gotículas lipídicas no parnchyma hepático, é uma característica fundamental da doença que precede a inflamação observada na esteatohepatite, fibrose e doença hepática em estágio terminal. O acúmulo de lipídios em hepatócitos pode interferir com o metabolismo adequado de xenobióticos e moléculas endógenas, bem como induzir processos celulares que levem ao avanço da doença. Embora o estudo experimental da esteatose possa ser realizado in vivo,abordagens in vitro para o estudo da esteatose são ferramentas complementares com diferentes vantagens. A cultura hepatocito em meio lipídico-condicionado é uma excelente opção reprodutível para o estudo da esteatose hepática que permite a identificação de processos celulares relacionados ao acúmulo de lipídios, como estresses oxidativos e reticulares, autofagia, proliferação, morte celular, etc, bem como outros testes, incluindo eficácia de drogas, e testes toxicológicos, entre muitas outras aplicações possíveis. Aqui, teve como objetivo descrever a metodologia da cultura celular hepatocitada em meio lipídios condicionados por sobrecarga. As células hepG2 foram cultivadas em RMPI 1640 médio condicionado com palmitato de sódio e oleato de sódio. É importante ressaltar que a razão desses dois lipídios é crucial para favorecer o acúmulo de gotículas lipídicas, mantendo a proliferação celular e uma taxa de mortalidade moderada, como ocorre no fígado durante a doença. A metodologia, a partir da preparação dos estoques de solução lipídica, mistura, além do meio, e cultura hepatócida é mostrada. Com essa abordagem, é possível identificar gotículas lipídicas nos hepatócitos que são prontamente observáveis pela mancha O vermelha-óleo, bem como curvas de taxas de proliferação/mortalidade.

Introduction

Fígado gorduroso associado à disfunção metabólica é altamente prevalente em todo o mundo^1,2; estima-se que até 25% da população seja afetada³. Esta doença anteriormente conhecida como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), atualizou sua nomenclatura para disfunção metabólica associada à doença hepática gordurosa (MAFLD) para refletir com precisão a patogênese relacionada à obesidade, resistência à insulina, diabetes tipo 2 e dislipidemia, bem como os possíveis manejos da doença^3,4.

Independentemente do nome, a doença inclui um amplo espectro de alterações histopatológicas caracterizadas pelo acúmulo anormalmente alto de lipídios no fígado (>5% de gordura nos hepatócitos⁵) e pode progredir através do acúmulo lipídudo tipicamente encontrado em esteatose simples à esteatohepatite, o que por sua vez pode levar ao desenvolvimento de fibrose, cirrose, carcinoma hepatocelular e insuficiência hepática^5,6,7,8. Devido à sua crescente prevalência, espera-se que o MAFLD se torne a primeira indicação de transplante hepático e a principal causa do carcinoma hepatocelular⁹.

Embora tenha sido considerada como uma forma benigna ou leve de doença hepática gordurosa, a esteatose hepática é de fato a chave metabólica no MAFLD¹⁰. Diferentes vias metabólicas são afetadas pelo acúmulo de lipídios no fígado, incluindo, mas não se limitando à síntese lipídica, exportação e metabolismo¹⁰. Resistência à insulina, estresse oxidativo, estresse reticular e disfunção celular estão fortemente associados à lipotoxicidade hepática^11,12. Por outro lado, hepatócitos gordurosos são alvo de espécies reativas de oxigênio, tornando metabólitos como peróxidos lipídicos, carbonilas proteicas e adutos de ácidos nucleicos¹³. No nível celular, hepatócitos gordurosos podem sofrer danos mitocondriais¹⁴, senescência celular¹⁵, apoptose^16,pioptose¹²e autofagia^17,entre outros eventos.

Hepatocitas são altamente responsáveis pelo metabolismo, desintoxicação e síntese de uma ampla gama de moléculas. Muitas dessas funções podem ser comprometidas pelo acúmulo lipídudo observado na esteatose. Portanto, é de grande importância ter ferramentas reprodutíveis que permitam uma avaliação precisa da esteatose. Nesse sentido, os modelos in vitro são prontamente aplicáveis e altamente reprodutíveis. Esteatose in vitro tem sido usada com diferentes gols^16,18,19. As células HepG2 são amplamente utilizadas como linha celular hepatocitte. Tem vantagens como ser fácil de cultivar e bem caracterizado. Talvez, a única desvantagem das células HepG2 seja o fato de ser uma linha celular cancerígena, por isso isso deve ser considerado ao analisar os desfechos. Aqui, mostra-se a aplicação de uma mistura de ácidos graxos amplamente utilizados na cultura celular: ácido palmítico (PA) e ácido oleico (OA). Tanto o PA quanto o OA oferecem resultados diferentes na cultura²⁰. Pa (C 16:0) é o ácido graxo saturado mais comum obtido da dieta¹⁶. A AF é considerada biomarcadora da lipogênese de-novo,um passo crucial no desenvolvimento do NAFLD²¹. Pa é mostrado como altamente tóxico²²; portanto, pode não ser recomendado induzir esteatose in vitro. OA (C 18:1) é um ácido graxo monoinsaturado. Em contraste com a AF, foi sugerido que a OA possui propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, sendo capaz de neutralizar a PA¹². Tanto a AF quanto a OA são os principais ácidos graxos presentes nos triglicérides, independentemente da condição de saúde ou doença¹⁶. A Tabela 1 fornece exemplos da cultura hepatocitte com PA, OA e sua mistura, bem como os resultados relatados^{12,23,24,25,26,27}. Outros ácidos graxos também têm sido utilizados na cultura hepatocita, incluindo ácido esteárico (C 18:0)^28,29,30, ácido linoleico (C 18:1)^28,30,31 e seus conjugados (CLA)^28,32, ácido palmitoleico (C 16:1)²⁹. No entanto, seu uso é menos frequentemente relatado na literatura, talvez porque sua abundância hepática é menor que a PA e OA¹⁶.

Em conjunto, ambos os ácidos graxos se assemelham à esteatose in vitro,proporcionando células proliferadoras, com maior morte celular e menor viabilidade em comparação com as condições de controle. Vale ressaltar que os respectivos sais desses ácidos graxos estão disponíveis e também podem ser usados. Um dos principais problemas na avaliação da sobrecarga lipídica na cultura celular hepatocitte é dado na diferenciação entre modelos toxicológicos e um modelo que melhor representa a esteatose. Muitos modelos podem ser contabilizados no primeiro caso. De fato, o uso apenas de PA pode ser considerado entre eles, e a alta mortalidade é o desfecho mais evidente^{12,16,23,24,25,26,27}. O uso de altas doses mesmo no caso de OA também pode ser considerado como um modelo toxicológico. O protocolo aqui mostrado está em maior conformidade com o desenvolvimento da esteatose, pois mostra baixa mortalidade em comparação com o observado em outros modelos e permite que seja seguido durante vários dias com acúmulo progressivo de lipídios como ocorre na NAFLD. A possibilidade de avaliar esteatose leve e grave por meio de condições experimentais é considerada outra vantagem.

Ácidos graxos	Condições		Resultados		Referência
PAPAI	Concentração: 200 μM		Acúmulo de lipídios		Yan et al, 201925.
	Exposição de tempo: 24 h		Dano à hepatocita
			Elevação de transminases
PAPAI	Concentração: 50, 100 e 200 μM		Acúmulo de lipídios		Xing et al, 201924.
	Exposição de tempo: 24 h
PAPAI	Concentração: 250 μM , 500 μM, 750 μM e 1.000 μM		Acúmulo de lipídios		Wang et al, 202026.
	Exposição de tempo: 24 h		Redução progressiva da viabilidade celular
Mistura de OA/PA	Concentração: 1 mM		Acúmulo de lipídios		Xiao et al, 202027.
	Exposição de tempo: 24 h		Não relata lipotoxicidade
	Taxa: 2OA:1PA
Mistura de OA/PA	Primeiro estimulação com 200 μM e 400 μM de PA e depois segundo estímulo com 200 μM de OA		Acúmulo de lipídios.		Zeng et al, 202012.
	Concentração:400 μM PA: 200 μM OA		A evidência de lipotoxicidade induzida pela AF foi reduzida por estimulação de OA.
	Taxa: 2PA:1OA
	Exposição de tempo: 24 h
Mistura de OA/PA	Concentração: 400 μM PA: 200 μM OA		Acúmulo de lipídios		Chen et al, 201823.
	Taxa: 2PA:1OA
	Exposição de tempo: 24 h
Mistura de OA/PA	Concentração :50 e 500 μM		Geração de dois tipos de esteatose: esteatose leve e esteatose grave.		Campos e Guzmán 2021
	Taxa: 2PA:1OA		Simula exposição crônica de sobrecarga lipídica
	Exposição de tempo: 24h, 2 dias,3 dias e 4 dias.

Mesa 1. Cultura hepatocita em condições esteatogênicas. A tabela apresenta o tipo de ácido graxo utilizado, as condições mantidas e os desfechos observados na cultura hepatócica. Pa: Ácido palmítico. Ácido oleico.

Por fim, este modelo é aplicável não apenas ao estudo da esteatose e fígado gorduroso, mas também às vias hepáticas metabólicas, sintéticas e desintoxicação no contexto da esteatose. Além disso, a esteatose in vitro induzida pode fornecer evidências para a identificação de potenciais marcadores da doença, bem como alvos terapêuticos.

Protocol

1. Preparação média padrão e condicionada Para preparar o RPMI padrão 1640, suplemente o meio de cultura RPMI 1640 com 10% (v/v) de soro bovino fetal (FBS, anteriormente inativado) e 1% (v/v) da solução penicilina-estreptomicina. Armazene o meio a 4 °C.Esterilizar usando filtros de 0,22 μm. Para preparar a solução de estoque palmitato, prepare uma solução de 50 mM de palmitato no RPMI padrão 1640 previamente suplementado com 1% de albumina de soro bovino (livre de lipídios). Um volume d…

Representative Results

Hepatócitos cultivados no meio esteatogênico apresentam crescimento em toda a superfície do poço; no entanto, hepatócitos gordurosos apresentam menor taxa de crescimento em comparação com células cultivadas no meio de controle. A proporção proposta e concentração de OA e PA, garantem a sobrevivência celular durante a cultura. Semear 1 x 105 células por poço em placas de 24 poços fornece confluência ideal como mostrado na Figura 1. A via…

Discussion

Este protocolo destina-se a fornecer uma estratégia para estudar esteatose in vitro. A cultura celular é uma ferramenta poderosa para estudar aspectos celulares, moleculares, bioquímicos e toxicológicos das células expostas a diferentes condições. Com essa abordagem, a esteatose pode ser visualizada não apenas como um estágio da doença complexa que é a MAFLD, mas também como a superexposição hepatocita aos lipídios e os possíveis desfechos resultantes dessa exposição. Portanto, sua aplicação …

Materials

Biosafety cabinet	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filter	Corning, US	430513	Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801	–
Hemocytometer	Marienfeld, DE	640010	–
HepG2 cell line	ATCC, US	HB-8065	Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubator	Thermo Electronic Corporation,US	Model: 3110	Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope Eclipse	NIKON, JPN	Model: TE2000-S	–
Isopropanol	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L	–
Oil Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit for histological visualization of neutral fat.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G	–
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meter	Beckman, US	Model: 360 PH/Temp/MV Meter	–
Phosphate buffered saline	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023	–
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1254.001	Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Preparation of culture media
Sodium oleate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A	–
Sodium palmitate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881	–
Syring filter	Corning, US	431219	Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G	–
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM	Corning, US	25-052-Cl	–
24 well cell culture cluster	Corning, US	3524	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture cluster	Corning, US	3599	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.