実験性脂肪化のモデル :脂質過負荷状態培地における肝細胞細胞培養
Summary
このプロトコルは、肝細胞の脂質への過剰暴露によって産生される脂肪、生化学的、細胞変化をイン ビトロでステアトーシスおよび分子、生化学的、細胞変化を研究するためのツールとなるものである。
Abstract
代謝機能障害関連脂肪肝疾患(MAFLD)は、以前は非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)として知られており、肥満、糖尿病2型、および脂質異常症との関係により、世界中で最も流行している肝疾患です。肝脂肪症は、肝臓の小板減少の蓄積、脂肪肝炎、線維症、および末期肝疾患で観察される炎症に先行する疾患の重要な特徴である。肝細胞の脂質蓄積は、異種生物および内因性分子の適切な代謝を妨げるだけでなく、疾患の進行につながる細胞プロセスを誘導する可能性がある。ステアトーシスの実験的研究は 生体内で行うことができるが、精間症の研究に 対するインビトロ アプローチは、異なる利点を有する補完的なツールである。脂質過負荷状態培地中の肝細胞培養は、酸化および網状ストレス、オートファジア、増殖、細胞死、細胞死などの脂質蓄積に関連する細胞プロセスの同定を可能にする肝脂肪症の研究のための優れた再現可能な選択肢であり、薬物の有効性、および毒物学的検査を含む他の多くの可能な用途の中で可能な他のアプリケーションの中で。ここでは、脂質過負荷状態培地における肝細胞培養の方法論を説明することを目的とした。ヘプG2細胞はパルミチン酸ナトリウム及びオレイン酸ナトリウムを用いてRMPI 1640培地で培養した。重要なことに、これら2つの脂質の比率は、疾患の間に肝臓で起こるように、細胞増殖および適度な死亡率を維持しながら、脂質液滴蓄積を支持するために重要である。方法論としては、脂質溶液ストックの調製から、混合物、培地への添加、および肝細胞培養が示される。このアプローチにより、油赤O染色によって容易に観察できる肝細胞中の脂質滴、ならびに増殖/死亡率の曲線を同定することができる。
Introduction
代謝機能障害に関連する脂肪肝は世界的に非常に普及しています1,2;人口の最大25%が3に影響を受けると推定されています。この疾患は、以前は非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)として知られており、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病2型、脂質異常症に関連する病因を正確に反映するように代謝機能不全に対するその命名法を更新した。3,4.
名前に関係なく、この疾患は肝臓における脂質の異常に高い蓄積(肝細胞5の脂肪の>5%)を特徴とする組織病理学的変化の広いスペクトルを含み、単純な脂肪症に典型的に見られる脂質蓄積を通じて進行する可能性があり、線維症、肝硬変の発症につながる可能性がある。 肝細胞癌、肝不全5、6、7、8.その増加の有病率のために, MAFLDは、肝移植の最初の徴候と肝細胞癌の主要な原因になると予想されます9.
それは、良性または軽度の形態の脂肪肝疾患として考えられてきましたが、肝性脂肪症は、実際にはMAFLD10の代謝キーです。異なる代謝経路は、肝臓における脂質蓄積の影響を受け、脂質合成、輸出、代謝10を含むがこれらに限定されない。インスリン抵抗性、酸化ストレス、網状ストレス、および細胞機能障害は、肝脂肪毒性11,12に強く関連している。一方、脂肪肝細胞は、活性酸素種の標的であり、代謝産物を過酸化脂質としてレンダリングし、タンパク質カルボニル、および核酸の付加物を13にする。細胞レベルでは、脂肪肝細胞はミトコンドリア損傷14、細胞老化15、アポトーシス16、ピロプトーシス12、およびオートファジア17を受ける可能性がある。
肝細胞は、幅広い分子の代謝、解毒、合成に大きな責任を負います。これらの機能の多くは、脂肪症で観察される脂質蓄積によって損なわれる可能性があります。.したがって、ステアトーシスの正確な評価を可能にする再現性のあるツールを持つことは非常に重要です。この意味で、in vitroモデルは容易に適用可能で、非常に再現可能である。体外のステアトーシスは、異なる目標16、18、19で使用されています。HepG2細胞は肝細胞細胞株として広く用いられている。それは、文化が容易で、よく特徴づけられるなどの利点を有する。おそらく、HepG2細胞の唯一の欠点は、発がん性細胞株であるという事実であるため、結果を分析する際に考慮する必要があります。ここで、細胞培養において広く用いられている脂肪酸の混合物の適用:パルミチン酸(PA)およびオレイン酸(OA)が示されている。PA と OA の両方が文化20で異なる結果を提供します。PA(C 16:0)は、ダイエット16から得られる最も一般的な飽和脂肪酸である。PAは、NAFLD21の開発における重要なステップである脱ノボリポジェネシスのバイオマーカーと考えられています。PAは毒性が高い22であることが示されている。したがって、体外でステアトーシスを誘発することは推奨されない場合があります。OA(C 18:1)は、一価不飽和脂肪酸である。PAとは対照的に、OAは、PA12に対抗することができる抗炎症および抗酸化特性を有することが示唆されている。PAとOAの両方が、健康または疾患16の状態に関係なく、トリグリセリドに存在する主脂肪酸である。表1は、PA、OA、およびそれらの混合物を含む肝細胞培養の例と、報告された結果が12、23、24、25、26、27である。他の脂肪酸は、ステアリン酸(C 18:0)28、29、30、リノール酸(C 18:1)28、30、31及びそのコンジュゲート(CLA)28、32、パルミトール酸(C16:1)29を含む肝細胞培養にも使用されている。しかし、その使用は、おそらく彼らの肝の豊富さがPAおよびOA16よりも低いため、文献で最も頻繁に報告される。
併用すると、両方の脂肪酸はインビトロで脂肪化に似ており、細胞の増殖を提供し、対照条件と比較して細胞死が増加し、生存率が低い。これらの脂肪酸のそれぞれの塩が利用可能であり、同様に使用することができることを言及する価値があります。肝細胞培養における脂質過多量を評価する際の主な問題の1つは、毒性モデルと脂肪沈殿を最もよく表すモデルとの分化において与えられる。多くのモデルは、最初のケースで説明することができます。実際には、PAの単独使用はそれらの中で考慮されるかもしれないし、高い死亡率は最も明白な結果である12、16、23、24、25、26、27。OAの場合でも高用量の使用は、毒物学的モデルとしても考えることができます。ここに示すプロトコルは、他のモデルで観察されたものと比較して低い死亡率を示し、NAFLDで発生する進行性脂質蓄積と数日間に従うことを可能にするので、ステアトーシスの発達に従って高い。実験条件を通じて軽度および重度のステアトーシスを評価する可能性は、別の利点と考えられる。
| 脂肪酸 | 条件 | 結果 | 参考 | ||
| お父さん | 濃度:200 μM | 脂質蓄積 | ヤンら、201925. | ||
| 時間露光:24時間 | 肝細胞の損傷 | ||||
| トランスアミンデス標高 | |||||
| お父さん | 濃度:50、100、200μM | 脂質蓄積 | Xingら, 201924. | ||
| 時間露光:24時間 | |||||
| お父さん | 濃度:250 μM、500 μM、750 μM、1,000 μM | 脂質蓄積 | 王ら, 202026. | ||
| 時間露光:24時間 | 細胞生存率の進行性の低下 | ||||
| OA/PAのミックス | 濃度:1mM | 脂質蓄積 | Xiaoらら、202027. | ||
| 時間露光:24時間 | リポ毒性を報告しない | ||||
| レート: 2OA:1PA | |||||
| OA/PAのミックス | PAの200 μMおよび400 μMの最初の刺激、そしてOAの200 μMの第2の刺激 | 脂質蓄積。 | Zengら, 202012. | ||
| 濃度:400 μM PA:200 μM OA | PAによって誘発されたリポ毒性の証拠は、OAの刺激によって減少した。 | ||||
| レート: 2PA:1OA | |||||
| 時間露光:24時間 | |||||
| OA/PAのミックス | 濃度:400 μM PA:200 μM OA | 脂質蓄積 | 陳ら, 201823. | ||
| レート: 2PA:1OA | |||||
| 時間露光:24時間 | |||||
| OA/PAのミックス | 濃度:50 μM | 2種類のステアトーシスの生成:軽度のステアトーシスと 重度のステアトーシス。 |
カンポスとグスマン 2021 | ||
| レート: 2PA:1OA | 脂質過負荷の慢性博覧をシミュレート | ||||
| 時間暴露:24時間、2日、3日、4日。 | |||||
表 1.肝細胞培養は、ステア原性の状態で。 表は、使用される脂肪酸の種類、維持された条件、および肝細胞培養における観察された結果を示す。PA:パルミチ酸。OA:オレイン酸。
最後に、このモデルは、脂肪、脂肪肝の研究だけでなく、脂肪のコンテキストで肝代謝、合成、および解毒経路にも適用されます。また、 インビトロ 誘発性ステアトーシスは、疾患の潜在的なマーカーおよび治療標的を同定するための証拠を提供するかもしれない。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、 体外でステアトーシスを研究するための戦略を提供することを目的としています。細胞培養は、細胞、分子、生化学的、および異なる条件にさらされた細胞の毒性学的側面を研究するための強力なツールです。このアプローチにより、脂肪症は、MAFLDである複雑な疾患の段階としてだけでなく、脂質への過剰暴露およびそのような暴露に起因する可能性のある結果?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、コンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(Conacyt、CB-221137)によって資金提供されました。アドリアナ・カンポスは、プログラム・デ・ドクマド・エン・シエンシアス・バイオメディカ、ナシオナル・エウトノマ・デ・メヒコ大学の博士課程の学生で、コナシト(CVU:1002502)によってサポートされました。
Materials
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | – |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | – |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | – |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | – |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | – |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | – |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | – |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | – |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | – |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | – |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | – |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | – |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
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