Un modello di steatosi sperimentale in vitro:coltura cellulare di epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico

Summary

Questo protocollo vuole essere uno strumento per studiare la steatosi e i cambiamenti molecolari, biochimici, cellulari prodotti dalla sovraeposizione degli epatociti ai lipidi in vitro.

Abstract

La steatosi epatica associata alla disfunzione metabolica (MAFLD), precedentemente nota come steatosi epatica non alcolica (NAFLD), è la malattia epatica più diffusa in tutto il mondo a causa della sua relazione con obesità, diabete di tipo 2 e dislipidemia. La steatosi epatica, l’accumulo di goccioline lipidiche nel parenchima epatico, è una caratteristica chiave della malattia che precede l’infiammazione osservata nella steatoepatite, nella fibrosi e nella malattia epatica allo stadio terminale. L’accumulo di lipidi negli epatociti potrebbe interferire con il corretto metabolismo degli xenobiotici e delle molecole endogene, nonché indurre processi cellulari che portano all’avanzamento della malattia. Sebbene lo studio sperimentale della steatosi possa essere eseguito in vivo, gli approcci in vitro allo studio della steatosi sono strumenti complementari con diversi vantaggi. La coltura di epatociti in un mezzo condizionato da sovraccarico lipidico è un’eccellente opzione riproducibile per lo studio della steatosi epatica che consente l’identificazione dei processi cellulari legati all’accumulo lipidico, come stress ossidativo e reticolare, autofagia, proliferazione, morte cellulare, eccetera, nonché altri test tra cui l’efficacia dei farmaci e test tossicologici, tra molte altre possibili applicazioni. Qui, aveva lo scopo di descrivere la metodologia della coltura cellulare degli epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico. Le cellule HepG2 sono state coltivate in terreno RMPI 1640 condizionato con palmitato di sodio e oleato di sodio. È importante sottolineare che il rapporto di questi due lipidi è fondamentale per favorire l’accumulo di goccioline lipidiche, pur mantenendo la proliferazione cellulare e un tasso di mortalità moderato, come accade nel fegato durante la malattia. Viene mostrata la metodologia, dalla preparazione delle scorte di soluzioni lipidiche, dalla miscela, dall’aggiunta al mezzo e dalla coltura degli epatociti. Con questo approccio, è possibile identificare goccioline lipidiche negli epatociti che sono facilmente osservabili dalla colorazione O rosso olio, nonché curve dei tassi di proliferazione / mortalità.

Introduction

Il fegato grasso associato alla disfunzione metabolica è altamente prevalente in tutto il mondo^1,2; si stima che fino al 25% della popolazione sia colpita³. Questa malattia precedentemente nota come steatosi epatica non alcolica (NAFLD), ha aggiornato la sua nomenclatura alla steatosi epatica associata alla disfunzione metabolica (MAFLD) per riflettere accuratamente la patogenesi correlata all’obesità, all’insulino-resistenza, al diabete di tipo 2 e alla dislipidemia, nonché le possibili gestione della malattia^3,4.

Indipendentemente dal nome, la malattia comprende un ampio spettro di cambiamenti istopatologici caratterizzati da un accumulo anormalmente elevato di lipidi nel fegato (>5% di grasso negli epatociti⁵) e potrebbe progredire attraverso l’accumulo lipidico tipicamente riscontrato nella steatosi semplice alla steatoepatite, che a sua volta potrebbe portare allo sviluppo di fibrosi, cirrosi, carcinoma epatocellulare e insufficienza^{epatica 5,6,7,8.} A causa della sua crescente prevalenza, MAFLD dovrebbe diventare la prima indicazione del trapianto di fegato e la principale causa di carcinoma epatocellulare⁹.

Sebbene sia stata considerata una forma benigna o lieve di malattia del fegato grasso, la steatosi epatica è in realtà la chiave metabolica in MAFLD¹⁰. Diverse vie metaboliche sono influenzate dall’accumulo di lipidi nel fegato, inclusi ma non limitati alla sintesi lipidica, all’esportazione e al metabolismo¹⁰. La resistenza all’insulina, lo stress ossidativo, lo stress reticolare e la disfunzione cellulare sono fortemente associati alla linotossicità^{epatica 11,12.} D’altra parte, gli epatociti grassi sono il bersaglio delle specie reattive dell’ossigeno, rendendo metaboliti come perossidi lipidici, carbonili proteici e addotti di acidi nucleici¹³. A livello cellulare, gli epatociti grassi potrebbero subire danni mitocondriali¹⁴, senescenza cellulare¹⁵, apoptosi¹⁶, piroptosi¹²e autofagia¹⁷, tra gli altri eventi.

Gli epatociti sono altamente responsabili del metabolismo, della disintossicazione e della sintesi di una vasta gamma di molecole. Molte di queste funzioni potrebbero essere compromesse dall’accumulo lipidico osservato nella steatosi. Pertanto, è di grande importanza disporre di strumenti riproducibili che consentano una valutazione accurata della steatosi. In questo senso, i modelli in vitro sono facilmente applicabili e altamente riproducibili. La steatosi in vitro è stata utilizzata con diversi obiettivi^16,18,19. Le cellule HepG2 sono ampiamente utilizzate come linea cellulare di epatociti. Ha vantaggi come essere facile da cultura e ben caratterizzato. Forse, l’unico svantaggio delle cellule HepG2 è il fatto che si tratta di una linea cellulare cancerogena, quindi questo deve essere considerato quando si analizzano i risultati. Qui, viene mostrata l’applicazione di una miscela di acidi grassi ampiamente utilizzati nella coltura cellulare: acido palmitico (PA) e acido oleico (OA). Sia PA che OA offrono risultati diversi nella cultura²⁰. PA (C 16:0) è l’acido grasso saturo più comune ottenuto dalla dieta¹⁶. La PA è considerata un biomarcatore della lipogenesi de-novo,un passo cruciale nello sviluppo della NAFLD^21. Il PA si è dimostrato altamente tossico²²; pertanto, potrebbe non essere raccomandato indurre la steatosi in vitro. OA (C 18:1) è un acido grasso monoinsaturo. In contrasto con la PA, l’OA è stato suggerito per possedere proprietà antinfiammatorie e antiossidanti, essendo in grado di contrastare PA¹². Sia PA che OA sono i principali acidi grassi presenti nei trigliceridi, indipendentemente dalle condizioni di salute o dalla malattia¹⁶. La Tabella 1 fornisce esempi della coltura di epatociti con PA, OA e la loro miscela, nonché i risultati riportati^{12,23,24,25,26,27.} Altri acidi grassi sono stati utilizzati anche nella coltura degli epatociti, tra cui l’acido stearico (C 18:0)^28,29,30,l’acido linoleico (C 18:1)^28,30,31 e i suoi coniugati (CLA)^28,32,l’acido palmitoleico (C 16:1)^29. Tuttavia, il loro uso è meno frequentemente riportato in letteratura, forse perché la loro abbondanza epatica è inferiore a PA e OA¹⁶.

In combinazione, entrambi gli acidi grassi assomigliano alla steatosi in vitro, fornendo cellule proliferanti, con aumento della morte cellulare e minore vitalità rispetto alle condizioni di controllo. Vale la pena ricordare che i rispettivi sali di questi acidi grassi sono disponibili e possono essere utilizzati pure. Uno dei problemi principali nella valutazione del sovraccarico lipidico nella coltura cellulare degli epatociti è dato nella differenziazione tra modelli tossicologici e un modello che rappresenta al meglio la steatosi. Molti modelli possono essere contabilizzati nel primo caso. In effetti, l’uso della PA da solo potrebbe essere considerato tra questi, e l’alta mortalità è l’esito più evidente^{12,16,23,24,25,26,27.} L’uso di dosi elevate anche nel caso di OA può anche essere considerato come un modello tossicologico. Il protocollo qui mostrato è in maggiore conformità con lo sviluppo della steatosi poiché mostra una bassa mortalità rispetto a quella osservata in altri modelli e consente di seguirlo per diversi giorni con accumulo lipidico progressivo come si verifica nella NAFLD. La possibilità di valutare la steatosi lieve e grave attraverso condizioni sperimentali è considerata un altro vantaggio.

Acidi	Condizioni		Risultati		Riferimento
BABBO	Concentrazione: 200 μM		Accumulo di lipidi		Yan et al, 201925.
	Tempo di esposizione: 24 h		Danno agli epatociti
			Elevazione delle transaminasi
BABBO	Concentrazione: 50, 100 e 200 μM		Accumulo di lipidi		Xing et al, 201924.
	Tempo di esposizione: 24 h
BABBO	Concentrazione: 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1.000 μM		Accumulo di lipidi		Wang et al, 202026.
	Tempo di esposizione: 24 h		Riduzione progressiva della vitalità cellulare
Mix di OA/PA	Concentrazione: 1 mM		Accumulo di lipidi		Xiao et al, 202027.
	Tempo di esposizione: 24 h		Non segnala linotossicità
	Tariffa: 2OA: 1PA
Mix di OA/PA	Prima stimolazione con 200 μM e 400 μM di PA e poi seconda stimolazione con 200 μM di OA		Accumulo di lipidi.		Zeng et al, 202012.
	Concentrazione:400 μM PA: 200 μM OA		L’evidenza di licotossicità indotta dalla PA è stata ridotta dalla stimolazione dell’OA.
	Tariffa: 2PA: 1OA
	Tempo di esposizione: 24 h
Mix di OA/PA	Concentrazione: 400 μM PA: 200 μM OA		Accumulo di lipidi		Chen et al, 201823.
	Tariffa: 2PA: 1OA
	Tempo di esposizione: 24 h
Mix di OA/PA	Concentrazione: 50 e 500 μM		Generazione di due tipi di steatosi: steatosi lieve e steatosi grave.		Campos e Guzmán 2021
	Tariffa: 2PA: 1OA		Simula l’esposizione cronica del sovraccarico lipidico
	Tempo di esposizione: 24 h, 2 giorni, 3 giorni e 4 giorni.

Tabella 1. Coltura di epatociti in condizioni steatogene. La tabella presenta il tipo di acido grasso utilizzato, le condizioni mantenute e i risultati osservati nella coltura degli epatociti. PA: Acido palmitico. OA: Acido oleico.

Infine, questo modello è applicabile non solo allo studio della steatosi e del fegato grasso, ma anche alle vie epatiche metaboliche, sintetiche e di disintossicazione nel contesto della steatosi. Inoltre, la steatosi indotta in vitro potrebbe fornire prove per l’identificazione di potenziali marcatori della malattia e bersagli terapeutici.

Protocol

1. Preparazione del mezzo standard e condizionato Per preparare rpmI 1640 standard, integrare il terreno di coltura RPMI 1640 con il 10% (v/v) di siero bovino fetale (FBS, precedentemente inattivato dal calore) e l’1% (v/v) di soluzione di penicillina-streptomicina. Conservare il mezzo a 4 °C.Sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 μm. Per preparare la soluzione stock di palmitato, preparare una soluzione di palmitato da 50 mM nello standard RPMI 1640 precedentemente integrato con l’1% di albumina s…

Representative Results

Gli epatociti coltivati nel mezzo steatogeno mostrano una crescita su tutta la superficie del pozzo; tuttavia, gli epatociti grassi mostrano un tasso di crescita inferiore rispetto alle cellule coltivate in mezzo di controllo. Il rapporto proposto e la concentrazione di OA e PA, garantiscono la sopravvivenza cellulare durante la coltura. La semina 1 x 105 cellule per pozzetti in piastre a 24 pozzetti fornisce una confluenza ottimale come mostrato nella Figura 1. <p class="jove…

Discussion

Questo protocollo ha lo scopo di fornire una strategia per studiare la steatosi in vitro. La coltura cellulare è un potente strumento per studiare gli aspetti cellulari, molecolari, biochimici e tossicologici delle cellule esposte a diverse condizioni. Con questo approccio, la steatosi può essere visualizzata non solo come uno stadio della malattia complessa che è MAFLD, ma anche come la sovraesposizione degli epatociti ai lipidi e i possibili esiti derivanti da tale esposizione. Pertanto, la sua applicazione…

Materials

Biosafety cabinet	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filter	Corning, US	430513	Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801	–
Hemocytometer	Marienfeld, DE	640010	–
HepG2 cell line	ATCC, US	HB-8065	Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubator	Thermo Electronic Corporation,US	Model: 3110	Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope Eclipse	NIKON, JPN	Model: TE2000-S	–
Isopropanol	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L	–
Oil Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit for histological visualization of neutral fat.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G	–
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meter	Beckman, US	Model: 360 PH/Temp/MV Meter	–
Phosphate buffered saline	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023	–
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1254.001	Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Preparation of culture media
Sodium oleate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A	–
Sodium palmitate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881	–
Syring filter	Corning, US	431219	Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G	–
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM	Corning, US	25-052-Cl	–
24 well cell culture cluster	Corning, US	3524	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture cluster	Corning, US	3599	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.