Un modelo de esteatosis experimental in vitro:cultivo de células de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica
Summary
Este protocolo pretende ser una herramienta para estudiar la esteatosis y los cambios moleculares, bioquímicos, celulares producidos por la sobreexposición de los hepatocitos a los lípidos in vitro.
Abstract
La enfermedad del hígado graso asociada a la disfunción metabólica (MAFLD), anteriormente conocida como enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), es la enfermedad hepática más prevalente en todo el mundo debido a su relación con la obesidad, la diabetes tipo 2 y la dislipidemia. La esteatosis hepática, la acumulación de gotas lipídicas en el parénquima hepático, es una característica clave de la enfermedad que precede a la inflamación observada en la esteatohepatitis, la fibrosis y la enfermedad hepática en etapa terminal. La acumulación de lípidos en los hepatocitos podría interferir con el metabolismo adecuado de los xenobióticos y las moléculas endógenas, así como inducir procesos celulares que conduzcan al avance de la enfermedad. Aunque el estudio experimental de la esteatosis se puede realizar in vivo, losenfoques in vitro para el estudio de la esteatosis son herramientas complementarias con diferentes ventajas. El cultivo de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica es una excelente opción reproducible para el estudio de la esteatosis hepática que permite la identificación de procesos celulares relacionados con la acumulación de lípidos, como tensiones oxidativas y reticulares, autofagia, proliferación, muerte celular, etcétera, así como otras pruebas que incluyen la eficacia de los fármacos y las pruebas toxicológicas, entre otras muchas posibles aplicaciones. Aquí, se tuvo como objetivo describir la metodología de cultivo de células de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica. Las células HepG2 se cultivaron en medio RMPI 1640 acondicionado con palmitato de sodio y oleato de sodio. Es importante destacar que la proporción de estos dos lípidos es crucial para favorecer la acumulación de gotas lipídicas, al tiempo que mantiene la proliferación celular y una tasa de mortalidad moderada, como ocurre en el hígado durante la enfermedad. Se muestra la metodología, a partir de la preparación de las existencias de solución lipídica, mezcla, adición al medio y cultivo de hepatocitos. Con este enfoque, es posible identificar gotas de lípidos en los hepatocitos que son fácilmente observables por tinción de O rojo aceite, así como curvas de tasas de proliferación / mortalidad.
Introduction
El hígado graso asociado con la disfunción metabólica es altamente prevalente en todo el mundo1,2; se estima que hasta el 25% de la población se ve afectada3. Esta enfermedad anteriormente conocida como enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), ha actualizado su nomenclatura a disfunción metabólica asociada a la enfermedad del hígado graso (MAFLD) para reflejar con precisión la patogénesis relacionada con la obesidad, la resistencia a la insulina, la diabetes tipo 2 y la dislipidemia, así como los posibles manejos de la enfermedad3,4.
Independientemente del nombre, la enfermedad incluye un amplio espectro de cambios histopatológicos caracterizados por una acumulación anormalmente alta de lípidos en el hígado (>5% de grasa en los hepatocitos5) y podría progresar a través de la acumulación de lípidos típicamente encontrada en la esteatosis simple a esteatohepatitis, que a su vez podría conducir al desarrollo de fibrosis, cirrosis, carcinoma hepatocelular e insuficiencia hepática5,6,7,8. Debido a su creciente prevalencia, se espera que MAFLD se convierta en la primera indicación de trasplante hepático y la principal causa de carcinoma hepatocelular9.
Aunque se ha considerado como una forma benigna o leve de enfermedad del hígado graso, la esteatosis hepática es de hecho la clave metabólica en MAFLD10. Diferentes vías metabólicas se ven afectadas por la acumulación de lípidos en el hígado, incluyendo pero no limitado a la síntesis de lípidos, la exportación y el metabolismo10. La resistencia a la insulina, el estrés oxidativo, el estrés reticular y la disfunción celular están fuertemente asociados a la lipotoxicidad hepática11,12. Por otro lado, los hepatocitos grasos son el objetivo de las especies reactivas de oxígeno, haciendo metabolitos como peróxidos lipídicos, carbonilos proteicos y aductos de ácidos nucleicos13. A nivel celular, los hepatocitos grasos pueden sufrir daño mitocondrial14,senescencia celular15,apoptosis 16,piroptosis12y autofagia17,entre otros eventos.
Los hepatocitos son altamente responsables del metabolismo, la desintoxicación y la síntesis de una amplia gama de moléculas. Muchas de estas funciones podrían verse comprometidas por la acumulación de lípidos observada en la esteatosis. Por lo tanto, es de gran importancia contar con herramientas reproducibles que permitan una evaluación precisa de la esteatosis. En este sentido, los modelos in vitro son fácilmente aplicables y altamente reproducibles. La esteatosis in vitro se ha utilizado con diferentes objetivos16,18,19. Las células HepG2 son ampliamente utilizadas como línea celular de hepatocitos. Tiene ventajas como ser fácil de cultivar y bien caracterizado. Quizás, la única desventaja de las células HepG2 es el hecho de que es una línea celular cancerígena, por lo que esto debe tenerse en cuenta al analizar los resultados. Aquí, se muestra la aplicación de una mezcla de ácidos grasos muy utilizada en cultivo celular: ácido palmítico (PA) y ácido oleico (OA). Tanto la AP como la OA ofrecen resultados diferentes en la cultura20. PA (C 16:0) es el ácido graso saturado más común obtenido de la dieta16. La AF es considerada como un biomarcador de lipogénesis de novo,un paso crucial en el desarrollo de NAFLD21. La AP ha demostrado ser altamente tóxica22; por lo tanto, es posible que no se recomiende inducir esteatosis in vitro. OA (C 18:1) es un ácido graso monoinsaturado. A diferencia de la AP, se ha sugerido que la OA posee propiedades antiinflamatorias y antioxidantes, pudiendo contrarrestar la PA12. Tanto la AF como la OA son los principales ácidos grasos presentes en los triglicéridos, independientemente del estado de salud o enfermedad16. La Tabla 1 proporciona ejemplos del cultivo de hepatocitos con AF, OA y su mezcla, así como los resultados informados12,23,24,25,26,27. Otros ácidos grasos también se han utilizado en el cultivo de hepatocitos, incluyendo el ácido esteárico (C 18:0)28,29,30,ácido linoleico (C 18:1)28,30,31 y sus conjugados (CLA)28,32,ácido palmitoleico (C 16:1)29. Sin embargo, su uso se informa con menos frecuencia en la literatura, tal vez porque su abundancia hepática es menor que PA y OA16.
En conjunto, ambos ácidos grasos se asemejan a la esteatosis in vitro,proporcionando células proliferantes, con mayor muerte celular y menor viabilidad en comparación con las condiciones de control. Vale la pena mencionar que las respectivas sales de estos ácidos grasos están disponibles y también se pueden usar. Uno de los principales problemas a la hora de valorar la sobrecarga lipídica en cultivo de células hepatocitarias se da en la diferenciación entre los modelos toxicológicos y el modelo que mejor representa la esteatosis. Muchos modelos se pueden contabilizar en el primer caso. De hecho, el uso de AF solo podría considerarse entre ellos, y la alta mortalidad es el resultado más evidente12,16,23,24,25,26,27. El uso de dosis altas incluso en el caso de OA también puede considerarse como un modelo toxicológico. El protocolo aquí mostrado es mayor acorde con el desarrollo de esteatosis ya que muestra baja mortalidad en comparación con la observada en otros modelos y permite seguirlo durante varios días con acumulación progresiva de lípidos tal y como ocurre en NAFLD. La posibilidad de evaluar la esteatosis leve y grave a través de condiciones experimentales se considera otra ventaja.
| Ácidos grasos | Condiciones | Resultados | Referencia | ||
| PAPÁ | Concentración: 200 μM | Acumulación de lípidos | Yan et al, 201925. | ||
| Tiempo de exposición: 24 h | Daño a hepatocitos | ||||
| Elevación de transaminasas | |||||
| PAPÁ | Concentración: 50, 100 y 200 μM | Acumulación de lípidos | Xing et al, 201924. | ||
| Tiempo de exposición: 24 h | |||||
| PAPÁ | Concentración: 250 μM, 500 μM, 750 μM y 1.000 μM | Acumulación de lípidos | Wang et al, 202026. | ||
| Tiempo de exposición: 24 h | Reducción progresiva de la viabilidad celular | ||||
| Mezcla de OA/PA | Concentración: 1 mM | Acumulación de lípidos | Xiao et al, 202027. | ||
| Tiempo de exposición: 24 h | No reporta lipotoxicidad | ||||
| Precio: 2OA:1PA | |||||
| Mezcla de OA/PA | Primera estimulación con 200 μM y 400 μM de PA y luego segunda estimulación con 200 μM de OA | Acumulación de lípidos. | Zeng et al, 202012. | ||
| Concentración: 400 μM PA: 200 μM OA | La evidencia de lipotoxicidad inducida por AF se redujo mediante la estimulación de la OA. | ||||
| Precio: 2PA:1OA | |||||
| Tiempo de exposición: 24 h | |||||
| Mezcla de OA/PA | Concentración: 400 μM PA: 200 μM OA | Acumulación de lípidos | Chen et al, 201823. | ||
| Precio: 2PA:1OA | |||||
| Tiempo de exposición: 24 h | |||||
| Mezcla de OA/PA | Concentración: 50 y 500 μM | Generación de dos tipos de esteatosis: esteatosis leve y esteatosis severa. |
Campos y Guzmán 2021 | ||
| Precio: 2PA:1OA | Simula la exposición crónica de la sobrecarga lipídica | ||||
| Tiempo de exposición: 24 h, 2 días, 3 días y 4 días. | |||||
Tabla 1. Cultivo de hepatocitos en condiciones esteatogénicas. La tabla presenta el tipo de ácido graso utilizado, las condiciones mantenidas y los resultados observados en el cultivo de hepatocitos. PA: Ácido palmítico. OA: Ácido oleico.
Finalmente, este modelo es aplicable no solo al estudio de la esteatosis y el hígado graso, sino también a las vías metabólicas hepáticas, sintéticas y de desintoxicación en el contexto de la esteatosis. Además, la esteatosis inducida in vitro podría proporcionar evidencia para la identificación de marcadores potenciales de la enfermedad, así como objetivos terapéuticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo pretende proporcionar una estrategia para estudiar la esteatosis in vitro. El cultivo celular es una herramienta poderosa para estudiar aspectos celulares, moleculares, bioquímicos y toxicológicos de las células expuestas a diferentes condiciones. Con este enfoque, la esteatosis se puede visualizar no solo como una etapa de la enfermedad compleja que es MAFLD, sino también como la sobreexposición de los hepatocitos a los lípidos y los posibles resultados resultantes de dicha exposición. Por…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos es estudiante de doctorado en el Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, y contó con el apoyo del Conacyt (CVU: 1002502).
Materials
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | – |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | – |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | – |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | – |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | – |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | – |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | – |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | – |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | – |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | – |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | – |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | – |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
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