प्रयोगात्मक स्टेटोसिस इन विट्रोका एक मॉडल: लिपिड अधिभार-वातानुकूलित माध्यम में हेपेटोसाइट सेल संस्कृति
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य स्टेटोसिस और आणविक, जैव रासायनिक, सेलुलर परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण होना है जो विट्रो मेंलिपिड के लिए हेपेटोसाइट्स के ओवर एक्सपोजर द्वारा उत्पादित है।
Abstract
मेटाबोलिक डिसफंक्शन से जुड़ी फैटी लिवर डिजीज (MAFLD), जिसे पहले नॉन-अल्कोहलिक फैटी लिवर डिजीज (NAFLD) के नाम से जाना जाता था, मोटापे, डायबिटीज टाइप 2 और डिस्लिपिडेमिया के साथ अपने संबंधों के कारण दुनिया भर में सबसे प्रचलित लिवर डिजीज है । हेपेटिक स्टीटोसिस, लिवर पैरेन्चिमा में लिपिड बूंदों का संचय, स्टीटोहेपेटाइटिस, फाइब्रोसिस और अंत चरण जिगर की बीमारी में देखी गई सूजन से पहले की बीमारी की एक प्रमुख विशेषता है। हेपेटोसाइट्स में लिपिड संचय ज़ेनोबायोटिक्स और अंतर्जात अणुओं के उचित चयापचय के साथ-साथ सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रेरित करने के साथ-साथ रोग के अग्रिम के लिए अग्रणी हो सकता है। यद्यपि स्टीटोसिस का प्रायोगिक अध्ययन वीवो मेंकिया जा सकता है, लेकिन स्टीटोसिस के अध्ययन के लिए इन विट्रो दृष्टिकोण विभिन्न फायदों के साथ पूरक उपकरण हैं। लिपिड अधिभार-वातानुकूलित माध्यम में हेपेटोसिट संस्कृति हेपेटिक स्टीटोसिस के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट प्रजनन योग्य विकल्प है जो लिपिड संचय से संबंधित सेलुलर प्रक्रियाओं की पहचान की अनुमति देता है, जैसे ऑक्सीडेटिव और रेटिकुलर तनाव, ऑटोफैगिया, प्रसार, सेल डेथ, वगैरह, साथ ही दवा प्रभावशीलता सहित अन्य परीक्षण, और कई अन्य संभावित अनुप्रयोगों के बीच विष विज्ञान परीक्षण। यहां, इसका उद्देश्य लिपिड अधिभार-वातानुकूलित माध्यम में हेपेटोसाइट सेल संस्कृति की पद्धति का वर्णन करना था। हेपजी2 कोशिकाओं को आरएमपीआई 1640 मध्यम वातानुकूलित सोडियम पलमिटेट और सोडियम ओलेट के साथ सुसंस्कृत किया गया था। महत्वपूर्ण बात, इन दो लिपिड का अनुपात लिपिड बूंद संचय एहसान करने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि सेल प्रसार और एक मध्यम मृत्यु दर को बनाए रखने, के रूप में रोग के दौरान जिगर में होता है । लिपिड समाधान स्टॉक, मिश्रण, माध्यम के अलावा, और हेपेटोसाइट संस्कृति की तैयारी से कार्यप्रणाली दिखाई जाती है। इस दृष्टिकोण के साथ, हेपेटोसाइट्स में लिपिड बूंदों की पहचान करना संभव है जो तेल-लाल ओ धुंधला द्वारा आसानी से नमूदार हैं, साथ ही प्रसार/मृत्यु दर के घटता है ।
Introduction
मेटाबोलिक डिसफंक्शन से जुड़ा फैटी लिवर दुनिया भर में अत्यधिक प्रचलित है1,2. यह अनुमान है कि आबादी का 25% तक प्रभावित है3. इस बीमारी को पहले गैर-अल्कोहलिक फैटी लिवर डिजीज (NAFLD) के रूप में जाना जाता है, ने मोटापे, इंसुलिन प्रतिरोध, मधुमेह प्रकार 2, और डिस्लिपिडेमिया के साथ-साथ रोग3,4के संभावित प्रबंधनों से संबंधित रोगजनकों को सही ढंग से प्रतिबिंबित करने के लिए मेटाबोलिक डिसफंक्शन से जुड़े फैटी लिवर डिजीज (एमएएफएलडी) के लिए अपने नामकरण को अपडेट किया है।
नाम के बावजूद, इस रोग में लिवर में लिपिड के असामान्य रूप से उच्च संचय (हेपेटोसाइट्स5में वसा के >5%) की विशेषता वाले हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का एक विस्तृत स्पेक्ट्रम शामिल है और आमतौर पर स्टीटोहेपेटाइटिस के लिए सरल स्टीटोसिस में पाए जाने वाले लिपिड संचय के माध्यम से प्रगति हो सकती है, जिससे फाइब्रोसिस, सिरोसिस का विकास हो सकता है, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा, और यकृत विफलता5,6,7,8. इसकी बढ़ती व्यापकता के कारण, एमएएफएलडी को यकृत प्रत्यारोपण का पहला संकेत और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा 9 का प्रमुख कारणबननेकी उम्मीद है ।
यद्यपि इसे फैटी लिवर रोग का सौम्य या हल्का रूप माना गया है, लेकिन हेपेटिक स्टीटोसिस वास्तव में एमएएफएलडी10में मेटाबॉलिक कुंजी है। विभिन्न मेटाबोलिक रास्ते यकृत में लिपिड संचय से प्रभावित होते हैं, जिनमें लिपिड संश्लेषण, निर्यात और चयापचय10तक सीमित नहीं होता है। इंसुलिन प्रतिरोध, ऑक्सीडेटिव तनाव, रेटिकुलर तनाव, और सेलुलर शिथिलता हेपेटिक लिपोटॉक्सिकिटी11,12से दृढ़ता से जुड़े हुए हैं। दूसरी ओर, फैटी हेपेटोसाइट्स प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का लक्ष्य हैं, जो मेटाबोलाइट्स को लिपिड पेरोक्साइड, प्रोटीन कार्बोसिल और न्यूक्लिक एसिड13के एडक्ट्स के रूप में प्रतिपादित करते हैं। सेलुलर स्तर पर, फैटी हेपेटोसाइट्स को माइटोकॉन्ड्रियल क्षति14,सेलुलर सेनेसेंस15,एपोप्टोसिस16,पायरोप्टोसिस12और ऑटोफैगिया17,अन्य घटनाओं के बीच से गुजरना पड़ सकता है।
हेपेटोसाइट्स मेटाबोलिज्म, विषहरण और अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला के संश्लेषण के लिए अत्यधिक जिम्मेदार हैं। इनमें से कई कार्यों को स्टीटोसिस में देखे गए लिपिड संचय से समझौता किया जा सकता है। इसलिए, प्रजनन योग्य उपकरण होना बहुत महत्वपूर्ण है जो स्टीटोसिस के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। इस अर्थ में, इन विट्रो मॉडल आसानी से लागू होते हैं और अत्यधिक प्रजनन योग्य होते हैं। 16,18 ,19के विभिन्न लक्ष्यों के साथ विट्रो में स्टीटोसिस का उपयोग किया गया है । हेपजी2 कोशिकाओं का व्यापक रूप से हेपेटोसिटे सेल लाइन के रूप में उपयोग किया जाता है। यह इस तरह के संस्कृति के लिए आसान किया जा रहा है और अच्छी तरह से विशेषता के रूप में लाभ है । शायद, HepG2 कोशिकाओं का एकमात्र नुकसान तथ्य यह है कि यह एक कैंसरजनक सेल लाइन है, इसलिए परिणामों का विश्लेषण करते समय इस पर विचार किया जाना चाहिए। यहां, सेल संस्कृति में व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले फैटी एसिड के मिश्रण का उपयोग दिखाया गया है: पामिटिक एसिड (पीए) और ओलिक एसिड (ओए) दिखाया गया है। पीए और ओए दोनों ही संस्कृति20में अलग – अलग परिणाम देते हैं । PA (C 16:0) आहार16से प्राप्त सबसे आम संतृप्त फैटी एसिड है । पीए को डी-नोवो लिपोजेनेसिसका बायोमार्कर माना जाता है, जो एनएएफएलडी21के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है । पीए को अत्यधिक विषैला22दिखाया गया है । इसलिए, यह विट्रो मेंस्टेटोसिस प्रेरित करने की सिफारिश नहीं की जा सकती है . ओए (सी 18:1) एक मोनोअनसैचुरेटेड फैटी एसिड है। पीए के विपरीत, ओए को एंटी-भड़काऊ और एंटी-ऑक्सीडेंट गुणों के अधिकारी का सुझाव दिया गया है, जो पीए12का प्रतिकार करने में सक्षम है । स्वास्थ्य यारोगकी स्थिति की परवाह किए बिना पीए और ओए दोनों ही ट्राइग्लिसराइड्स में मौजूद मुख्य फैटी एसिड हैं। तालिका 1 पीए, ओए और उनके मिश्रण के साथ हेपेटोसाइट संस्कृति के उदाहरण प्रदान करता है, साथ ही परिणामों की रिपोर्ट12,23,24,25, 26,27। हेपेटोसाइट संस्कृति में अन्य फैटी एसिड का भी उपयोग किया गया है, जिसमें स्टेरिक एसिड (सी 18:0)28,29,30,लिनोलिक एसिड (सी 18:1)28,30, 31औरइसके संजूगेट्स (सीएलए)28, 32,पामिटोलिक एसिड (सी 16:1)29शामिल हैं। हालांकि, उनका उपयोग साहित्य में कम से कम बार सूचित किया जाता है, शायद इसलिए कि उनकी हेपेटिक बहुतायत पीए और ओए16की तुलना में कम है।
संयोजन के रूप में, दोनों फैटी एसिड विट्रो मेंस्टेटोसिस जैसा दिखता है, जो कोशिकाओं को बढ़ाने के साथ, बढ़ी हुई कोशिकाओं को प्रदान करता है और नियंत्रण स्थितियों की तुलना में कम व्यवहार्यता है। यह उल्लेखनीय है कि इन फैटी एसिड के संबंधित लवण उपलब्ध हैं और के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है लायक है । हेपेटोसिट सेल संस्कृति में लिपिड अधिभार का आकलन करते समय मुख्य समस्याओं में से एक विषविज्ञानी मॉडल और एक मॉडल के बीच भेदभाव में दिया जाता है जो सबसे अच्छा स्टीटोसिस का प्रतिनिधित्व करता है। पहले मामले में कई मॉडलों का हिसाब लगाया जा सकता है। वास्तव में, अकेले पीए के उपयोग को उनमें से माना जा सकता है, और उच्च मृत्यु दर सबसे स्पष्ट परिणाम12,16,23,24, 25,26,27है। ओए के मामले में भी हाई डोज के इस्तेमाल को टॉक्सिकोलॉजिकल मॉडल माना जा सकता है। यहां दिखाया गया प्रोटोकॉल स्टेटोसिस विकास के साथ उच्च अनुसार है क्योंकि यह अन्य मॉडलों में देखे गए कम मृत्यु दर को दिखाता है और इसे प्रगतिशील लिपिड संचय के साथ कई दिनों के दौरान पालन करने की अनुमति देता है क्योंकि यह NAFLD में होता है। प्रायोगिक स्थितियों के माध्यम से हल्के और गंभीर स्टेटोसिस का आकलन करने की संभावना को एक और लाभ माना जाता है।
| फैटी एसिड | शर्तों | परिणाम | संदर्भ | ||
| पीए | एकाग्रता: 200 माइक्रोन | लिपिड संचय | यान एट अल, 201925। | ||
| समय एक्सपोजर: 24 घंटे | हेपेटोसाइट क्षति | ||||
| ट्रांसामिनेस ऊंचाई | |||||
| पीए | एकाग्रता: 50, 100 और 200 माइक्रोन | लिपिड संचय | Xing एट अल, 201924. | ||
| समय एक्सपोजर: 24 घंटे | |||||
| पीए | एकाग्रता: 250 माइक्रोन, 500 माइक्रोन, 750 माइक्रोन और 1,000 माइक्रोन | लिपिड संचय | वांग एट अल, २०२०26। | ||
| समय एक्सपोजर: 24 घंटे | सेल व्यवहार्यता में उत्तरोत्तर कमी | ||||
| ओए/पीए का मिश्रण | एकाग्रता: 1 mM | लिपिड संचय | जिओ एट अल, २०२०27। | ||
| समय एक्सपोजर: 24 घंटे | लिपोटॉक्सिकिटी की रिपोर्ट नहीं करता है | ||||
| दर: 2OA:1PA | |||||
| ओए/पीए का मिश्रण | 200 माइक्रोन और पीए के 400 माइक्रोन के साथ पहली उत्तेजना और फिर ओए के 200 माइक्रोन के साथ दूसरी उत्तेजना | लिपिड संचय। | Zeng एट अल, 202012. | ||
| एकाग्रता: 400 माइक्रोन पीए: 200 माइक्रोन ओए | ओए की उत्तेजना से पीए द्वारा प्रेरित लिपोटॉक्सिकिटी के सबूत कम हो गए थे। | ||||
| दर: 2PA:1OA | |||||
| समय एक्सपोजर: 24 घंटे | |||||
| ओए/पीए का मिश्रण | एकाग्रता: 400 माइक्रोन पीए: 200 माइक्रोन ओए | लिपिड संचय | चेन एट अल, 201823। | ||
| दर: 2PA:1OA | |||||
| समय एक्सपोजर: 24 घंटे | |||||
| ओए/पीए का मिश्रण | एकाग्रता:50 और 500 माइक्रोन | दो प्रकार के स्टेटोसिस का उत्पादन: हल्के स्टीटोसिस और गंभीर स्टीटोसिस। |
कैम्पोस और गुज़मान 2021 | ||
| दर: 2PA:1OA | लिपिड अधिभार की पुरानी प्रदर्शनी का अनुकरण करता है | ||||
| समय एक्सपोजर: 24 घंटे, 2 दिन, 3 दिन और 4 दिन। | |||||
तालिका 1. स्टीटोजेनिक स्थितियों में हेपेटोसाइट संस्कृति। तालिका में उपयोग किए जाने वाले फैटी एसिड के प्रकार, बनाए रखी गई स्थितियों और हेपेटोसिट संस्कृति में देखे गए परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं। पीए: पामिटिक एसिड। ओए: ओलिक एसिड।
अंत में, यह मॉडल न केवल स्टीटोसिस और फैटी लिवर के अध्ययन के लिए लागू होता है, बल्कि स्टीटोसिस के संदर्भ में हेपेटिक मेटाबोलिक, सिंथेटिक और विषहरण मार्गों पर भी लागू होता है। इसके अलावा, इन विट्रो प्रेरित स्टेटोसिस रोग के संभावित मार्कर के साथ-साथ चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान के लिए सबूत प्रदान कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य विट्रो मेंस्टीटोसिस का अध्ययन करने के लिए एक रणनीति प्रदान करना है। सेल कल्चर विभिन्न स्थितियों के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं के सेलुलर, आणविक, जैव रासायनिक और विषविज्ञ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कोंसेजो नैसिनल डी सिएंसिया वाई टेक्नोलोगिया (कोनसिट, सीबी-221137) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एड्रियाना कैम्पोस प्रोग्रामा डी डॉक्टराडो एन सिएंसियास बायोमेडिस, यूनीवर्सिड नैसिनल ऑटोनोमा डी मैक्सीको में डॉक्टरेट छात्र हैं, और कोनासिट (सीवीयू: 1002502) द्वारा समर्थित थे।
Materials
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | – |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | – |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | – |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | – |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | – |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | – |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | – |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | – |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | – |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | – |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | – |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | – |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
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