RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

Summary

Qui descriviamo le fasi di raccolta e preparazione dei campioni per RIBO-seq nei batteri. Il sequenziamento delle biblioteche elaborate secondo queste linee guida si traduce in dati sufficienti per un’analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è semplice, utilizza attrezzature di laboratorio standard e richiede sette giorni dalla lisi all’ottenimento delle biblioteche.

Abstract

La tecnica di profilazione ribosoma (RIBO-seq) è attualmente lo strumento più efficace per studiare il processo di sintesi proteica in vivo. Il vantaggio di questo metodo, rispetto ad altri approcci, è la sua capacità di monitorare la traduzione mappando con precisione la posizione e il numero di ribosomi su una trascrizione di mRNA.

In questo articolo, descriviamo le fasi consecutive della raccolta e della preparazione dei campioni per il metodo RIBO-seq nei batteri, evidenziando i dettagli rilevanti per la pianificazione e l’esecuzione dell’esperimento.

Poiché il RIBO-seq si basa su ribosomi intatti e mRNA correlati, il passo chiave è la rapida inibizione della traduzione e un’adeguata disintegrazione delle cellule. Pertanto, suggeriamo la filtrazione e il congelamento flash nell’azoto liquido per la raccolta cellulare con un pretrattamento opzionale con cloramfenicolo per arrestare la traduzione nei batteri. Per la disintegrazione, proponiamo la macinazione di cellule congelate con malta e pestello in presenza di ossido di alluminio per interrompere meccanicamente la parete cellulare. In questo protocollo non è richiesto un cuscino di saccarosio o un ultracentrifugazione gradiente di saccarosio per la purificazione monosomatica. Invece, viene applicata la separazione dell’mRNA utilizzando l’elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGE) seguita dall’escissione dell’impronta ribosomiale (banda 28-30 nt) e fornisce risultati soddisfacenti. Ciò semplifica in gran parte il metodo e riduce i tempi e i requisiti delle apparecchiature per la procedura. Per la preparazione della biblioteca, si consiglia di utilizzare il piccolo kit di RNA disponibile in commercio per il sequenziamento Illumina da New England Biolabs, seguendo le linee guida del produttore con un certo grado di ottimizzazione.

Le librerie cDNA risultanti presentano la quantità e la qualità appropriate necessarie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Il sequenziamento delle librerie preparate secondo il protocollo descritto comporta da 2 a 10 mln letture mappate in modo univoco per campione fornendo dati sufficienti per un’analisi bioinformatica completa. Il protocollo che presentiamo è rapido e relativamente semplice e può essere eseguito con apparecchiature di laboratorio standard.

Introduction

La tecnica di profilazione ribosoma (RIBO-seq) è stata sviluppata nel laboratorio di Jonathan Weissman presso l’Università della California, San Francisco^1. Rispetto ad altri metodi usati per studiare l’espressione genica a livello traslazionale, RIBO-seq si concentra su ogni legame ribosoma all’mRNA e fornisce informazioni sulla sua posizione e sul numero relativo di ribosomi su una trascrizione. Consente di monitorare il processo di sintesi proteica in vivo e può fornire una risoluzione e una precisione del codone singolo consentendo la misurazione della densità ribosoma su entrambi, il singolo mRNA e lungo l’intero trascrittame nella cellula. Alla base della tecnica RIBO-seq si trova il fatto che durante la traduzione il ribosoma lega la molecola di mRNA e quindi protegge il frammento sepolto della trascrizione da una digestione della ribonucleasi. Dopo l’aggiunta della ribonucleasi, l’mRNA non protetto viene digerito e i frammenti racchiusi da ribosomi – tipicamente lunghi ~28-30 nt – rimangono intatti. Questi frammenti, chiamati impronte ribosomiali (RF), possono quindi essere isolati, sequenziati e mappati sulla trascrizione da cui hanno avuto origine con conseguente rilevamento della posizione esatta dei ribosomi. Infatti, la capacità ribosoma di proteggere i frammenti di mRNA è stata utilizzata dagli anni ’60 per studiare i siti di rilegatura ribosomiale e iniziazione alla traduzione (TIS)^2,3,4. Tuttavia, con l’avanzamento della tecnologia di sequenziamento profondo, RIBO-seq è diventato un gold standard per il monitoraggio della^{traduzione 5} che, attraverso l’impegno ribosoma, può fornire informazioni a livello genomico sulla sintesi proteica⁶. La profilazione ribosoma ha colmato il divario tecnologico esistente tra la quantificazione del trascrittame e il proteoma^6.

Per condurre la profilazione ribosoma è necessario ottenere il lisato cellulare dell’organismo che era cresciuto nelle condizioni studiate. Interrompere queste condizioni durante la raccolta e lalisi cellulare può fornire dati inaffidabili. Per evitare ciò, vengono comunemente utilizzati inibitori della traduzione, raccolta rapida e congelamento lampo nell’azoto liquido. Le cellule possono essere lisciviate mediante macinazione criogenica in un omogeneizzatore meccanico come un miscelatore^7,8 o un battitore di^{perline 9}e per triturazione attraverso una pipetta¹⁰ o con un ago¹¹. Il tampone di lysis può essere aggiunto poco prima o poco dopo la polverizzazione delle cellule. Nel nostro protocollo utilizziamo azoto liquido per preraffreddare malta e pestello, così come l’ossido di alluminio come approccio più delicato all’interruzione della parete cellulare batterica, che impedisce la tosatura dell’RNA spesso riscontrata quando vengono applicati metodi come la sonificazione. Dopo la polverizzazione, aggiungiamo un tampone di lisi ghiacciata nel contenuto raffreddato della malta. La selezione di un buffer di lisi appropriato è importante per ottenere la migliore risoluzione delle impronte ribosomiali. Poiché la forza ionica influisce sia sulla dimensione RF che sulla precisione del fotogramma di lettura, si consiglia attualmente di utilizzare buffer di lisi con bassa forza ionica e capacità tampone, anche se sembra che la composizione tampone non influenzi l’occupazione ribosomiale su mRNA^11,12. Componenti importanti del tampone di lisi sono gli ioni di magnesio, la cui presenza previene la dissociazione delle subunità ribosomiali e inibisce i cambiamenti conformazionali spontanei nei ribosomi^{batterici 11,13}. Anche gli ioni di calcio svolgono un ruolo significativo e sono essenziali per l’attività della nucleasi micrococcica (MNasi) utilizzata nel metodo di profilazione ribosoma^{batterica 14}. L’aggiunta di guanosina 5′-[β,γ-imido]trifosfato (GMP-PNP), un analogo non idrolabile di GTP, insieme al cloramfenicolo inibisce la traduzione durante la lisi¹⁵.

Quando il lisato viene ottenuto, viene chiarito per centrifugazione e diviso in due porzioni, ognuna per un RIBO-seq e un sequenziamento totale dell’mRNA ad alta produttività (RNA-seq) poiché vengono eseguite simultaneamente(Figura 1). RNA-seq fornisce un punto di riferimento che consente il confronto dei dati sia ribo-seq che RNA-seq durante l’analisi dei dati. Il translatoma studiato è definito dalla normalizzazione delle impronte ribosomiche all’abbondanza di mRNA¹⁶. I dati di RNA-seq possono anche aiutare a identificare la clonazione o sequenziare gli^{artefatti 17}.

Figura 1. Schemi di preparazione del campione di mRNA per RIBO-seq e RNA-seq. Per la preparazione della libreria RIBO-seq, l’RNA viene digerito con MNasi (A), seguito dalla selezione delle dimensioni di RF di ~28-30 nt di lunghezza (B); per l’RNA RNA-seq è isolato (C), impoverito di rRNA (D), e l’mRNA risultante è frammentato casualmente in frammenti di varie lunghezze (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I primi passi della procedura di preparazione del campione per RIBO-seq e RNA-seq differiscono leggermente (Figura 1). Per la profilazione ribosomiale, il lisato deve essere digerito da una specifica endonucleasi per degradare le molecole di mRNA non protette dai ribosomi. Nei protocolli standard, i monosomi ottenuti vengono recuperati da un cuscino di saccarosio ultracentrifugato o da un gradiente di saccarosio ultracentrifugazione^8,14. In questo articolo, mostriamo che questo passaggio non è necessario per isolare RF richiesto per il RIBO-seq nei batteri, allo stesso modo per le cellule eucariotiche¹⁸e che la selezione delle dimensioni dei frammenti di mRNA di lunghezza appropriata dal gel di poliacrilammide è sufficiente.

Per l’RNA-seq, l’mRNA è ottenuto dall’esaurimento dell’rRNA dalle molecole totali di RNA – rRNA che si ibridano alle sonde oligonucleotidi biotinylate che si legano alle perline magnetiche rivestite di streptavidina. I complessi rRNA-oligonucleotide-perline vengono quindi rimossi dal campione con un magnete con conseguente campionamento impoverito di rRNA^19,20. Le molecole di mRNA purificate vengono quindi frammentate casualmente per idrolisi alcalina. I frammenti ottenuti di mRNA e le impronte ribosomiali vengono convertiti in librerie cDNA e preparati per il sequenziamento profondo (Figura 2). Ciò comporta la riparazione delle estremità necessaria dopo l’idrolisi alcalina (per mRNA) e la digestione enzimatica (per RF): defosforilazione di 3′ estremità seguita da fosforilazione di 5′ estremità. I passaggi successivi sono la legatura degli adattatori e la trascrizione inversa per creare inserti cDNA incorniciati da sequenze necessarie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS) utilizzando la piattaforma Illumina. L’ultima fase della preparazione della libreria è una reazione PCR in cui i costrutti vengono amplificati ed etichettati con codici a barre specifici del campione per consentire il multiplexing e il sequenziamento di vari campioni su un canale. Prima del sequenziamento, la qualità e la quantità delle librerie sono valutate dall’elettroforesi su chip del DNA ad alta sensibilità. Le librerie cDNA con parametri appropriati possono quindi essere raggruppate e sequenziate. Il sequenziamento può essere eseguito su diverse piattaforme Illumina, come MiSeq, NextSeq o HighSeq, a seconda del numero di librerie, della lunghezza di lettura e della profondità di sequenziamento richieste. Dopo il sequenziamento, viene eseguita l’analisi bioinformatica.

Figura 2. Preparazione della biblioteca. La preparazione della libreria include la riparazione delle estremità, la legatura degli adattatori, la trascrizione inversa e l’amplificazione con codifica a barre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La profilazione ribosoma è un metodo universale che può essere facilmente modificato e regolato in base alla questione scientifica. Originariamente è stato utilizzato nel^{lievito 1,}ma poco dopo è stato applicato alle cellule^{batteriche 21} così come agli organismi modello eucariotico tra cui topo^10,zebrafish^22,mosca della^{frutta 23} e Arabidopsis thaliana^24. È stato anche usato per studiare diversi tipi di ribosomi: citoplasmatico, mitocondriale^25,26 e cloroplasto^27,28. Negli eucarioti RIBO-seq è comunemente adattato e raffinato per indagare aspetti specifici della traduzione, tra cui^{iniziazione 10,11,29,30,31,32,allungamento 1,10,11,31,33,}ribosoma stallo³³ e modifica conformazione³³. La maggior parte delle modifiche comporta l’uso di diversi inibitori della traduzione. Nei batteri, tuttavia, studi analoghi sono stati difficili da condurre a causa della scarsità di inibitori con il meccanismo d’azione^{richiesto 34}. L’inibitore della traduzione più comunemente usato nei batteri è il cloramfenicolo (CAM) che si lega al centro peptidil transferasi (PTC) e impedisce il corretto posizionamento dell’amminoacil-tRNA nel sito A. Di conseguenza, CAM impedisce la formazione di un legame peptidico che porta ad arrestare i ribosomi allunganti³⁵. Altri esempi di inibitori della traduzione nei batteri sono la tetraciclina (TET)³⁶, la retapamulina (RET)³⁴ e l’Onc112^{37 che sono} stati utilizzati per studiare i siti di iniziazione alla traduzione. TET, che impedisce la consegna di tRNA al ribosoma sovrapponendosi direttamente con l’anello staminali anticodonte del tRNA nel sito A, è stato originariamente applicato per verificare i risultati ottenuti dal trattamento CAM poiché sono entrambi antibiotici che inibiscono l’allungamento della^{traslazione 38}. Tet è stato trovato per rilevare tis primario, tuttavia non è stato in grado di rivelare tis^{36 interno}. Il RET si lega nel PTC del ribosoma batterico e previene la formazione del primo legame peptidico interferendo con un aminoacil-tRNA allungatore nel sito A. L’applicazione del RET comporta l’arresto dei ribosomi sia al TISs³⁴primario che a quello interno. Onc112, un peptide antimicrobico ricco di prolina, si lega nel tunnel di uscita e blocca il legame amminoacil-tRNA nel sito ribosomiale A. Di conseguenza, Onc112 impedisce ai complessi di iniziazione di entrare nella fase di^{allungamento 37}.

La principale profilazione ribosoma delle informazioni fornisce la densità dei ribosomi e la loro posizione sull’mRNA. È stato applicato con successo per studiare l’espressione genica differenziale a livello di traduzione in varie condizioni di^{crescita 1,6,}misurare l’efficienza traslazionale^{1,38,39 e} rilevare eventi di regolazione della traduzione come la pausa ribosomiale¹⁰. RIBO-seq consente inoltre di scoprire la traduzione di ncRNA annotato, pseudogeni e piccoli telai di lettura aperti senza preavviso (ORF) che portano all’identificazione di geni di codifica proteica nuovi e/o molto brevi^{10,12,22,30,37}. In questi casi, RIBO-seq può perfezionare e migliorare l’annotazione del genoma. Con la sua elevata sensibilità per l’identificazione degli ORF tradotti e la sua natura quantitativa, la profilazione ribosoma può anche servire da proxy per la determinazione del proteoma o per aiutare gli studi di proteomica^31,34,39. Mappando TIS, la profilazione ribosoma rivela isoforme estese e troncate N-terminale di proteine^{note 10,32}. RIBO-seq è stato anche adattato per studiare il ripiegamento co-traslazionale^{delle proteine 14,21,24}. Questo metodo consente di misurare i tassi di^{allungamento 1,10,39} o velocità di decodifica dei singoli^{codoni 6} e aiuta a sviluppare modelli quantitativi di^{traduzione 17}. Il metodo di profilazione ribosoma è anche in grado di fornire approfondimenti meccanicistici sulla pausa ribosoma nei^{batteri 7,15,17,}frameshifting^40,stop-codon readthrough^21,difetti di terminazione /riciclaggio^41,42 e modifiche alla conformazione ribosomiale³³ negli eucarioti. RIBO-seq è stato anche adattato per esaminare l’impatto di specifici fattori trans-acting sulla traduzione come le miRNA^{6 e} le proteine leganti l’RNA negli eucarioti^16,43. Tuttavia, è importante riconoscere che il progetto sperimentale e la risoluzione ottenuta di RIBO-seq determinano la quantità di informazioni che possono essere estratte dai dati di sequenziamento^{risultanti 12}.

Protocol

1. Raccolta dei campioni Preparare una coltura batterica. Si consiglia un volume di coltura di 100 mL per campione. Preparare attrezzature e reagenti per la raccolta dei campioni: due scoopula per campione, filtri sterili a membrana di cellulosa mista (MCE) da 0,45 μm, tubi sterili da 50 ml, azoto liquido, 50 mg/mL di cloramfenicolo nel 70% (vol/vol) di etanolo (facoltativo). Forare il coperchio di tubi da 50 ml per consentire l’evaporazione dell’azoto liquido e prevenire l’esplosione di tubi chiusi….

Representative Results

I risultati esemplari qui presentati sono stati ottenuti in uno studio che esamina la regolazione della traduzione nelle cellule subtili sporulate di Bacillus bacillus. Le colture notturne sono state diluite in OD600 pari a 0,1 in 100 mL di mezzo ricco e incubate a 37 °C con scuotimenti vigorosi fino a quando L’OD600 ha raggiunto 0,5-0,6. Il ricco mezzo è stato quindi sostituito con un mezzo minimo per indurre il processo di sporulazione e l’incubazione è stata continuata per un massimo …

Discussion

La sfida tecnica chiave della profilazione ribosoma è la necessità di inibire rapidamente la traduzione al fine di catturare un’istantanea dei ribosomi sugli mRNA in un particolare stato fisiologico di interesse. A tal fine, vengono comunemente utilizzati inibitori della traduzione, raccolta rapida e congelamento flash nell’azoto liquido. L’applicazione di antibiotici è facoltativa poiché possono causare artefatti. Il cloramfenicolo è un farmaco comunemente usato per arrestare i ribosomi allunganti nel ribo-seq batt…

Materials

10X TBE (powder)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure	Acros Organics	125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a.	Chempur	114560600
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramphenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free	Roche	4716728001
EDTA disodium salt	Fisher Scientific	E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Filtration apparatus	VWR Collection	511-0265	all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A&A Biotechnology	040-500
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE membrane fiter	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification	Invitrogen	AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina	New England Biolabs	E7300S
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Concentrator -25	Zymo Research	R1018
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Life Technologies	S11494
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer	New England Biolabs	B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach:ner	40096-AP0