RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

Summary

Aquí se describen las etapas de la recolección de muestras y la preparación de RIBO-seq en bacterias. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con estas directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es simple, utiliza equipos de laboratorio estándar y tarda siete días desde la lisis hasta la obtención de bibliotecas.

Abstract

La técnica de perfilado de ribosomas (RIBO-seq) es actualmente la herramienta más eficaz para estudiar el proceso de síntesis de proteínas in vivo. La ventaja de este método, en comparación con otros enfoques, es su capacidad para monitorear la traducción mediante el mapeo preciso de la posición y el número de ribosomas en una transcripción de ARNm.

En este artículo, se describen las etapas consecutivas de la recolección de muestras y la preparación para el método RIBO-seq en bacterias, destacando los detalles relevantes para la planificación y ejecución del experimento.

Puesto que el RIBO-seq confía en los ribosomas intactos y los mRNAs relacionados, el paso dominante es la inhibición rápida de la traducción y la desintegración adecuada de células. Por lo tanto, sugerimos la filtración y la congelación flash en nitrógeno líquido para la recolección celular con un pretratamiento opcional con cloranfenicol para detener la traducción en bacterias. Para la desintegración, proponemos moler las células congeladas con mortero y pestle en presencia de óxido de aluminio para alterar mecánicamente la pared celular. En este protocolo, no se requiere un cojín de sacarosa o una ultracentrifugación de gradiente de sacarosa para la purificación del monosoma. En lugar, la separación del mRNA usando la electroforesis del gel de la poliacrilamida (PÁGINA) seguida por la supresión ribosómica de la huella (venda de 28-30 nt) se aplica y proporciona resultados satisfactorios. Esto simplifica en gran medida el método, así como reduce los requisitos de tiempo y equipo para el procedimiento. Para la preparación de la biblioteca, recomendamos usar el pequeño kit de ARN disponible comercialmente para la secuenciación de Illumina de New England Biolabs, siguiendo las pautas del fabricante con cierto grado de optimización.

Las bibliotecas de ADNc resultantes presentan la cantidad y calidad adecuadas requeridas para la secuenciación de próxima generación (NGS). La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con el protocolo descrito da como resultado de 2 a 10 mln lecturas mapeadas de forma única por muestra, lo que proporciona datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es rápido y relativamente fácil y se puede realizar con equipos de laboratorio estándar.

Introduction

La técnica de perfilado de ribosomas (RIBO-seq) fue desarrollada en el laboratorio de Jonathan Weissman de la Universidad de California, San Francisco^1. En comparación con otros métodos utilizados para estudiar la expresión génica a nivel traslacional, RIBO-seq se centra en cada ribosoma que se une al ARNm y proporciona información sobre su ubicación y el número relativo de ribosomas en una transcripción. Permite monitorizar el proceso de síntesis de proteínas in vivo y puede proporcionar resolución y precisión de un solo codón permitiendo la medición de la densidad del ribosoma tanto en el ARNm individual como a lo largo de todo el transcriptoma de la célula. En la fundación de la técnica RIBO-seq se encuentra el hecho de que durante la traducción el ribosoma se une a la molécula de ARNm y por lo tanto protege el fragmento enterrado de la transcripción de una digestión ribonucleasa. Sobre la adición de la ribonucleasa, el mRNA desprotegido se digiere y los fragmentos encerrados por los ribosomas – típicamente de ~28-30 nt de largo – permanecen intactos. Estos fragmentos, llamados huellas ribosómicas (RF), pueden ser aislados, secuenciados y mapeados en la transcripción de la que se originaron, lo que resulta en la detección de la posición exacta de los ribosomas. De hecho, la capacidad del ribosoma para proteger los fragmentos de ARNm se ha utilizado desde la década de 1960 para estudiar la unión ribosómica y los sitios de iniciación a la traducción (TIS)^2,3,4. Sin embargo, con el avance en la tecnología de secuenciación profunda, RIBO-seq se ha convertido en un estándar de oro para el monitoreo de la traducción⁵ que, a través del compromiso del ribosoma, puede proporcionar una información de todo el genoma sobre la síntesis de proteínas^6. El perfilado de ribosomas llenó el vacío tecnológico que existía entre la cuantificación del transcriptoma y el^{proteoma 6.}

Para llevar a cabo el perfilado de ribosomas necesitamos obtener el lisoto celular del organismo que había crecido en las condiciones investigadas. La interrupción de estas condiciones durante la recolección y lisis celular puede proporcionar datos poco confiables. Para prevenir esto, los inhibidores de la traducción, la cosecha rápida y la congelación repentina en nitrógeno líquido se utilizan comúnmente. Las células pueden ser lisadas por molienda criogénica en un homogeneizador mecánico como un molino mezclador^7,8 o un batidor de perlas^9,y por trituración a través de una pipeta¹⁰ o con una aguja^11. El tampón de lisis se puede agregar justo antes o poco después de la pulverización de las células. En nuestro protocolo utilizamos nitrógeno líquido para preenfriar mortero y pestle, así como óxido de aluminio como un enfoque más suave para la interrupción de la pared celular bacteriana, lo que evita la cizalladura de ARN que a menudo se encuentra cuando se aplican métodos como la sonificación. Después de la pulverización, añadimos un tampón de lisis helada en el contenido enfriado del mortero. La selección de un tampón de lisis adecuado es importante para obtener la mejor resolución de las huellas ribosómicas. Dado que la resistencia iónica afecta tanto al tamaño de RF como a la precisión del marco de lectura, actualmente se recomienda utilizar tampones de lisis con baja resistencia iónica y capacidad de tampón, incluso si parece que la composición del tampón no afecta a la ocupación ribosómica en arns^11,12. Los componentes importantes del tampón de lisis son los iones de magnesio, cuya presencia impide la disociación de las subunidades ribosómicas e inhibe los cambios conformacionales espontáneos en los ribosomas bacterianos^11,13. Los iones de calcio también juegan un papel importante y son esenciales para la actividad de la nucleasa microcócica (MNase) utilizada en el método de perfilado de ribosomas bacterianos¹⁴. La adición de guanosina 5′-[β,γ-imido]trifosfato (GMP-PNP), un análogo no hidrolizable de GTP, junto con cloranfenicol inhibe la traducción durante la lisis¹⁵.

Cuando se obtiene el lisato, se clarifica por centrifugación y se divide en dos porciones, cada una para un RIBO-seq y una secuenciación de ARNm total de alto rendimiento (ARN-seq) ya que se realizan simultáneamente (Figura 1). El ARN-seq proporciona un punto de referencia que permite la comparación de datos tanto de RIBO-seq como de ARN-seq durante el análisis de datos. El translatoma investigado se define por la normalización de las huellas ribosómicas a la abundancia de^{ARNm 16}. Los datos de RNA-seq también pueden ayudar a identificar artefactos de clonación o secuenciación¹⁷.

Figura 1. Schematics of mRNA sample preparation for RIBO-seq and RNA-seq. Para la preparación de la biblioteca RIBO-seq, el ARN se digiere con MNase (A), seguido por la selección del tamaño de RF de ~28-30 nt de longitud (B); para el ARN-seq el ARN se aísla (c), agotado del rRNA (d), y el mRNA resultante se hace fragmentos aleatoriamente en los fragmentos de longitudes diversas (e). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Los pasos iniciales del procedimiento de preparación de muestras para RIBO-seq y ARN-seq difieren ligeramente (Figura 1). Para el perfilación ribosómica, el lisoto necesita ser digerido por una endonucleasa específica para degradar las moléculas de ARNm no protegidas por los ribosomas. En los protocolos estándar, los monosomas obtenidos son recuperados mediante una ultracentrifugación de cojín de sacarosa o una ultracentrifugación de gradiente de sacarosa^8,14. En este artículo, mostramos que este paso no es necesario para aislar la RF requerida para el RIBO-seq en bacterias, así mismo para las células eucariotas^18,y que la selección del tamaño de los fragmentos de ARNm de longitud adecuada del gel de poliacrilamida es suficiente.

Para el ARN-seq, el mRNA es obtenido por el agotamiento del rRNA del ARN total – las moléculas del rRNA hibridan a las puntas de prueba biotinylated del oligonucleótido que atan a los perlas magnéticos streptavidin-revestidos. Los complejos rRNA-oligonucleótido-perlas se eliminan de la muestra con un imán dando como resultado una muestra agotada de ARNr^19,20. Las moléculas purificadas del mRNA entonces son fragmentadas aleatoriamente por hidrólisis alcalina. Los fragmentos obtenidos de ARNm, así como las huellas ribosómicas se convierten en bibliotecas de ADNc y se preparan para la secuenciación profunda (Figura 2). Esto implica la reparación de los extremos necesarios después de la hidrólisis alcalina (para el mRNA) y de la digestión enzimática (para el RF): dephosphorylation de los extremos 3′ seguidos por la fosforilación de los extremos de 5′. Los siguientes pasos son la ligadura de adaptadores y la transcripción inversa para crear insertos de ADNc enmarcados por secuencias requeridas para la secuenciación de próxima generación (NGS) utilizando la plataforma Illumina. La última fase de la preparación de la biblioteca es una reacción de PCR en la que las construcciones se amplifican y etiquetan con códigos de barras específicos de la muestra para permitir la multiplexación y secuenciación de varias muestras en un canal. Antes de la secuenciación, la calidad y la cantidad de las bibliotecas se evalúan mediante la electroforesis en chip de ADN de alta sensibilidad. Las bibliotecas de ADNc con los parámetros adecuados se pueden agrupar y secuenciar. La secuenciación se puede realizar en diferentes plataformas Illumina, como MiSeq, NextSeq o HighSeq, dependiendo del número de bibliotecas, la longitud de lectura requerida y la profundidad de secuenciación. Después de la secuenciación, se realiza el análisis bioinformático.

Figura 2. Preparación de la biblioteca. La preparación de la biblioteca incluye la reparación de los extremos, la ligadura de los adaptadores, la transcripción inversa y la amplificación con código de barras. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

El perfilado de ribosomas es un método universal que puede modificarse y ajustarse fácilmente de acuerdo con la pregunta científica. Originalmente se utilizaba en la levadura^1,pero poco después se aplicó a las células bacterianas^21, así como a organismos modelo eucariotas como el ratón^10,el pez cebra^22,la mosca de la fruta²³ y Arabidopsis thaliana^24. También se utilizó para el estudio de diferentes tipos de ribosomas: citoplasmático, mitocondrial^25,26 y cloroplasto^27,28. En eucariotas RIBO-seq es comúnmente adaptado y refinado para investigar aspectos específicos de la traducción, incluyendo la iniciación^{10,11,29,30,31,32,}el alargamiento^{1,10,11,31, 33,}ribosoma estancamiento³³ y cambio de conformación^33. La mayoría de las modificaciones implican el uso de diferentes inhibidores de la traducción. En bacterias sin embargo, estudios análogos han sido difíciles de realizar debido a la escasez de inhibidores con el mecanismo de acción requerido³⁴. El inhibidor de la traducción más comúnmente utilizado en bacterias es el cloranfenicol (CAM) que se une al centro de la peptidil transferasa (PTC) e impide la correcta colocación del aminoacil-ARNt en el sitio A. Como resultado, cam previene la formación de un enlace peptídico que conduce a la detención de los ribosomas alargados³⁵. Otros ejemplos de inhibidores de la traducción en bacterias son la tetraciclina (TET)^36,la retapamulina (RET)³⁴ y la Onc112^37, que se han utilizado para investigar los sitios de iniciación a la traducción. La TET, que impide la entrega de ARNt al ribosoma mediante la superposición directa con el tallo-as del anticodón del ARNt en el sitio A, se aplicó originalmente para verificar los resultados obtenidos del tratamiento con CAM, ya que ambos son antibióticos que inhiben la elongación de la traducción^38. Se encontró que TET detectaba TIS primario, sin embargo, no pudo revelar TIS³⁶interno. Ret se une en el PTC del ribosoma bacteriano, y previene la formación del primer enlace peptídico interfiriendo con un aminoacil-ARNt elongador en el sitio A. La aplicación de RET da lugar a la detención de los ribosomas tanto en el TISs primario como en el interno^34. Onc112, un péptido antimicrobiano prolina-rico, ata en el túnel de la salida y bloquea el atascamiento aminoacyl-tRNA en el sitio ribosomal de A. Como resultado, Onc112 evita que los complejos de iniciación entren en la fase de elongación^37.

La principal información que proporciona el perfilado de ribosomas es la densidad de los ribosomas y su posición sobre el ARNm. Se aplicó con éxito para investigar la expresión génica diferencial a nivel de traslación en diversas condiciones de crecimiento^1,6,medir la eficiencia traslacional^1,38,39 y detectar eventos de regulación de la traducción como la pausa ribosómica^10. RIBO-seq también permite descubrir la traducción de ncRNA anotado, pseudogenes y pequeños marcos de lectura abiertos no anotados (ORF) que conducen a la identificación de genes codificantes de proteínas nuevos y /o muy cortos^{10,12,22,30,37.} En tales casos, RIBO-seq puede afinar y mejorar la anotación del genoma. Con su alta sensibilidad para la identificación de ORFs traducidos y su naturaleza cuantitativa, el perfilado de ribosomas también puede servir como un proxy para la determinación del proteoma o en la ayuda a los estudios de proteómica^31,34,39. Mediante el mapeo de TIS, el perfilado de ribosomas revela isoformas N-terminalmente extendidas y truncadas de proteínas conocidas^10,32. RIBO-seq también se adaptó para estudiar el plegamiento co-traslacional de proteínas^14,21,24. Este método permite medir las tasas de elongación^1,10,39 o velocidades de decodificación de codones individuales⁶ y ayuda en el desarrollo de modelos cuantitativos de traslación^17. El método de perfilado de ribosomas también es capaz de proporcionar información mecanicista sobre la pausa del ribosoma en bacterias^7,15,17,cambio de marco^40,lectura de codones de parada^21,defectos de terminación /reciclaje^41,42 y cambios de conformación ribosómica³³ en eucariotas. RIBO-seq también se adaptó para examinar el impacto de factores específicos de acción trans en la traducción, como los miRNAs⁶ y las proteínas de unión a ARN en eucariotas^16,43. Sin embargo, es importante reconocer que el diseño experimental y la resolución obtenida de RIBO-seq determinan la cantidad de información que puede ser extraída de los datos de secuenciación^{resultantes 12.}

Protocol

1. Recogida de muestras Preparar un cultivo bacteriano. Recomendamos un volumen de cultivo de 100 mL por muestra. Preparar equipos y reactivos para la recolección de muestras: dos scápulas por muestra, filtros estériles de membrana de ésteres de celulosa (MCE) mixtos de 0,45 μm, tubos estériles de 50 mL, nitrógeno líquido, 50 mg/mL de cloranfenicol en etanol al 70% (vol/vol) (opcional). Pinchar la tapa de tubos de 50 mL para permitir la evaporación de nitrógeno líquido y evitar la explosió…

Representative Results

Los resultados ejemplares presentados aquí se obtuvieron en un estudio que examina la regulación de la traducción en células de los subtilis del Bacilo wt esporulantes. Los cultivos nocturnos se diluyeron a OD600 igual a 0,1 en 100 mL de medio rico y se incubaron a 37 °C con agitación vigorosa hasta que OD600 alcanzó 0,5-0,6. El medio rico fue reemplazado por un medio mínimo para inducir el proceso de esporulación y la incubación se continuó hasta por cuatro horas. Las células f…

Discussion

El desafío técnico clave del perfilado de ribosomas es la necesidad de inhibir rápidamente la traducción para capturar una instantánea de ribosomas en ARNm en un estado fisiológico particular de interés. Para lograr esto, los inhibidores de la traducción, la cosecha rápida y la congelación flash en nitrógeno líquido se utilizan comúnmente. La aplicación de antibióticos es opcional, ya que pueden causar artefactos. El cloranfenicol es un fármaco de uso común para detener los ribosomas alargados en ribo-se…

Materials

10X TBE (powder)	Invitrogen	AM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, pure	Acros Organics	125472500
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Aluminium oxide calcinated pure p.a.	Chempur	114560600
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramphenicol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4004
Dnase I recombinant, Rnase-free	Roche	4716728001
EDTA disodium salt	Fisher Scientific	E/P140/48
Ethyl Alcohol Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
Filtration apparatus	VWR Collection	511-0265	all-glass filtration apparatus, with funnel, fritted base, cap, 47 mm Ø spring clamp and ground joint flask
Gel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, Blue, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A&A Biotechnology	040-500
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE membrane fiter	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	pore size: 0.45um
MICROBExpress Bacterial mRNA Purification	Invitrogen	AM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina	New England Biolabs	E7300S
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937
Potassium Acetate Anhydrous Pure P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Concentrator -25	Zymo Research	R1018
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	223530-500G
Sodium hydrogen carbonate pure p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Life Technologies	S11494
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer	New England Biolabs	B0201S
TBE-Urea Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, ultrapure, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Urea G.R.	lach:ner	40096-AP0