자기 적고를 이용한 세포 밀도 및 항원 적 특성의 정량화
Summary
이 논문은 고정 밀도를 가진 포획 구슬의 부양 높이의 변화를 정량화하여 용해성 또는 멤브레인 바운드항원들의 존재를 구체적으로 검출할 수 있는 자기 부양 기반 방법을 설명합니다.
Abstract
설명된 방법은 자기 적 부상의 원리에 기초하여 개발되었으며, 이는 밀도와 자기 특성에 따라 세포와 입자를 분리합니다. 밀도는 그 대사 속도, 분화 및 활성화 상태와 직접적으로 관련된 특성을 식별하는 세포 유형입니다. 자기 부양은 순환 혈액 세포를 성공적으로 분리, 이미지 및 특성화하고 빈혈, 겸상적혈구 질환 및 밀도 및 자기 특성에 따라 순환 종양 세포를 검출하는 1 단계 접근법을 허용합니다. 이러한 접근법은 또한 각각 포획 및 검출 항체로 코팅된 저밀도 비드 세트를 사용하여 용액에 존재하는 수용성 항원들을 검출할 수 있다. 항원이 용액에 존재하는 경우, 두 세트의 구슬을 교개하여 항체 코팅 구슬의 행 사이에 부과되는 새로운 구슬 비드 복합체를 생성합니다. 용액에서 표적 항원의 농도가 증가하면 항원 농도가 낮아지면 더 많은 수의 비드 비드 복합체가 생성되어 표적 항원의 정량적 측정이 가능합니다. 자기 부상은 감소된 시료 준비 시간과 고전적인 판독 방법에 대한 의존도 부족으로 인해 다른 방법에 유리하다. 생성된 이미지는 스마트폰이나 태블릿과 같은 표준 현미경 또는 모바일 장치를 사용하여 쉽게 캡처및 분석할 수 있다.
Introduction
자기부상은 세포 유형1,2,3,단백질4,5 및 오피오이드6을 특정 밀도 및 파라자성 특성에 기초하여 분리, 분석 및 식별하도록 개발된 기술입니다. 세포 밀도는 대사율 및 분화상태7,8,9,10,11,12,13,14와직접 관련된 각 세포 유형의고유하고본질적인 특성이다. 꾸준한 상태 조건 동안 세포 밀도에 미묘 하 고 일시적인 변화를 정량화, 그리고 다양 한 세포 과정 동안, 세포 생리학 및 병리 생리학에 대 한 타의 추종을 불허 하는 통찰력을 감당할 수 있습니다. 세포 밀도의 변화는 세포분화(15,16,세포 주기 진행9,17,18,19,세포 세포세포20,21,22, 23및 악성 변환24,25,26)와 연관된다. . 따라서, 세포 밀도의 특정 변화의 정량화는, 다양한 활성화 과정을 겪고 있는 세포의 동일 모형 사이에서 차별할 뿐만 아니라, 다른 모형의 세포를 분화하기 위하여 이용될 수 있다. 이를 통해 특정 세포 하위 집단을 대상으로 하는 실험을 가능하게 하며, 밀도의 동적 변화는 변화된 세포대사(27)의지표역할을 한다. 변화하는 환경에 대응하여 세포가 밀도를 변경할 수 있다는 것이 확립된 바와 같이7,그 밀도와 관련하여 세포의 역학을 측정하여 이를 완전히 이해하는 것이 필수적이며, 현재 의 방법은12를제공하지 않을 수 있다. 반면에 자기 부상은 세포 및 그성질(28)의동적 평가를 허용한다.
세포는 영구적인 자기 이폴 순간이 없다는 것을 의미하는 다각성입니다. 그러나, 외부 자기장에 노출되면, 약한 자기 이폴 모멘트는 적용된 필드의 반대 방향으로, 세포에서 생성된다. 따라서, 세포가 파라마그네틱 용액에서 중단되고 강한 수직 자기장에 노출된 경우, 자기 원에서 벗어나 높이로 멈추게 되며, 이는 주로 개별 밀도에 따라 달라집니다. 두 가지 기준이 충족될 때 불균일 자기장의 최소에 국한된 물체의 다이내자기 부유가 가능합니다: 1) 입자의 자기 감수성은 주변 매체보다 작아야 하며, 2) 자기력은 입자의 부력력에 대항할 만큼 충분히 강해야 한다. 두 기준 모두 자기 완충에서 RBC를 일시 중단하고 작고 저렴하며 시판되는 영구 자석1을가진 강력한 자기장 그라데이션을 만들어 달성 할 수 있습니다. 중력방향을 따라 축상에 자기적으로 갇힌 입자의 평형 위치는 밀도(버퍼밀도에 비해), 자기 감수성(완충의 자기 감수성에 대한) 및 적용된 자기장의 시그니처에 의해 결정된다. 용액의 밀도와 자기 특성이 시스템 전반에 걸쳐 일정하기 때문에, 세포의 본질적인 밀도 특성은 덜 조밀한 세포에 비해 더 낮은 상승하는 조밀한 세포와 함께 세포의 부양 높이를 결정하는 주요 요인이 될 것이다. 이 방법은 밀도 측정을 위해 정밀하고 비율 측정 분석을 사용할 수 있는 두 개의 밀도 참조 구슬(1.05 및 1.2 g/mL) 집합을 사용합니다. 자기 용액의 농도를 변경하면 순환 세포의 밀도가 세포에 특정이므로 CBC에서 RBC와 같은 다른 세포 집단을 분리하여 격리 프로토콜 또는 기타 세포 조작의 필요성을 제거할 수 있습니다.
생물학 연구에 사용되는 검출 방법의 대부분은 선형 신호를 정량화하기 쉬운 특정 결합 이벤트의 추정에 의존한다. 이러한 판독 방법은 종종 복잡하고 특수 장비 및 전담 과학 인력이 포함됩니다. 세포의 혈장 막또는 세포외 소포의 혈장 막에서 발견되거나 플라즈마에서 용해되는 항원의 검출을 겨냥한 접근법은 하나 또는 두 개의 항체 코팅 구슬을 사용하여 본원에 설명되어 있습니다. 구슬은 서로, 심문대상의 밀도가 서로 달라야 한다. 임의의 주어진 생체 유체에서 표적 항원의 존재는 검출 비드에 바인딩되는 항원 양성 세포의 부양 높이에 있는 특정, 측정 가능한 변화로 변환됩니다. 용해성 항원 또는 세포 외 소포의 경우, 비드 세포 복합체가 아닌 비드 비드 복합체를 형성하여 포획 및 검출 비드 모두에 바인딩됩니다. 부양 높이의 변화는 비드 셀 또는 비드 비드 복합체의 새로운 밀도에 따라 달라집니다. 생물유체에서 항원의 존재를 나타내는 복합체의 부양 높이의 변화 외에도, 복합체의 수는 표적의 양에도 의존하여 자기 적 발화를 하는 것 또한 항원검출(24)에대한 정량적 접근법이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그라데이션 원심분리는 현재 고유한 밀도를 기반으로 하위 셀룰러 구성 요소를 격리하는 표준 기술입니다. 그러나 이러한 접근 방식은 전문 그라데이션 미디어와 원심분리기 장비를 사용해야 합니다. 여기에 제시된 자기 부양 접근법은 순환 세포의 형태학적 및 기능적 특성에 대한 상세한 조사를 최소한으로 허용하며, 세포의 조작이 있는 경우 순환 세포에 대한 생체 내 접근을 제공한다.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 세포 외 소포 작업에 대한 그의 도움에 대한 박사 Getulio 페레이라에게 감사드립니다.
이 작품은 ICG에 다음과 같은 국립 보건 원에 의해 지원되었다: RO1CA218500, UG3HL147353, UG3TR002881.
Materials
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
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