القياس الكمي للكثافة الخلوية والخصائص المضادة للجينات باستخدام الارتفاع المغناطيسي
Summary
تصف هذه الورقة طريقة قائمة على الارتفاع المغناطيسي يمكنها الكشف على وجه التحديد عن وجود المستضدات ، إما قابلة للذوبان أو مقيدة بالغشاء ، عن طريق تحديد التغيرات في ارتفاع ارتفاع حبات الالتقاط ذات الكثافات الثابتة.
Abstract
تم تطوير الطريقة الموصوفة على أساس مبادئ الارتفاع المغناطيسي ، الذي يفصل بين الخلايا والجسيمات على أساس كثافتها وخصائصها المغناطيسية. الكثافة هي نوع الخلية تحديد الممتلكات، ترتبط مباشرة إلى معدل الأيض، والتمايز، وحالة التنشيط. يسمح الارتفاع المغناطيسي بنهج خطوة واحدة لفصل خلايا الدم المتداولة بشكل ناجح، وصورها وتوصيفها، والكشف عن فقر الدم، وأمراض الخلايا المنجلية، وتعميم الخلايا السرطانية على أساس الكثافة والخصائص المغناطيسية. هذا النهج قابل أيضا للكشف عن المستضدات القابلة للذوبان الموجودة في محلول باستخدام مجموعات من الخرز منخفض الكثافة وعالي الكثافة المغلفة بالأجسام المضادة للالتقاط والكشف ، على التوالي. إذا كان المستضد موجودا في الحل ، فإنه سيتم جسر مجموعتين من الخرز ، وتوليد مجمع حبة حبة جديدة ، والتي سوف ترتفع بين صفوف الخرز المغلفة بالأجسام المضادة. زيادة تركيز المستضد المستهدف في المحلول سوف تولد عددا أكبر من مجمعات حبة الخرز بالمقارنة مع تركيزات أقل من المستضد، مما يسمح بإجراء قياسات كمية للمضاد المستهدف. الارتفاع المغناطيسي مفيد لطرق أخرى بسبب انخفاض وقت إعداد العينة وعدم الاعتماد على طرق القراءة الكلاسيكية. يتم التقاط الصورة التي تم إنشاؤها بسهولة وتحليلها باستخدام المجهر القياسي أو الجهاز المحمول، مثل الهاتف الذكي أو الكمبيوتر اللوحي.
Introduction
الارتفاع المغناطيسي هو تقنية تم تطويرها لفصل وتحليل وتحديد أنواع الخلايا1و2و3والبروتينات4و5 والمواد الأفيونية6 استنادا فقط إلى كثافتها المحددة وخصائصها المغناطيسية. كثافة الخلية هي فريدة من نوعها، خاصية جوهرية من كل نوع الخلية ذات الصلة مباشرة لمعدل الأيض والتمايز حالة7،8،9،10،11،12،13،14. إن تحديد التغيرات الدقيقة والعابرة في كثافة الخلايا خلال ظروف الحالة الثابتة، وخلال مجموعة متنوعة من عمليات الخلايا، يمكن أن يوفر للمرء نظرة ثاقبة لا مثيل لها في فسيولوجيا الخلايا والفيزيولوجيا المرضية. وترتبط التغيرات في كثافة الخلية مع تمايز الخلية15،16، تطور دورة الخلية9،17،18،19، موت الخلايا المبرمج20،21،22،23، والتحول الخبيث24،25،26 . لذلك ، يمكن استخدام القياس الكمي للتغيرات المحددة في كثافة الخلايا ، للتمييز بين الخلايا من أنواع مختلفة ، وكذلك التمييز بين نفس النوع من الخلايا التي تخضع لعمليات تنشيط مختلفة. وهذا يمكن التجارب التي تستهدف خلية معينة من السكان الفرعيين، حيث التغيرات الديناميكية في الكثافة بمثابة مؤشر على تغيير استقلاب الخلية27. كما ثبت أن الخلية قد تغير كثافتها استجابة لبيئة متغيرة7، فمن الضروري قياس حركية الخلية فيما يتعلق بكثافتها لفهمها بشكل كامل ، والتي قد لا توفرها الطرق الحالية12. الارتفاع المغناطيسي من ناحية أخرى، يسمح لتقييم ديناميكي للخلايا وخصائصها28.
الخلايا هي ثنائية المغناطيسية بمعنى أنها لا تملك لحظة ثنائي القطب المغناطيسي الدائم. ومع ذلك ، عندما تتعرض لحقل مغناطيسي خارجي ، يتم إنشاء لحظة ثنائي القطب المغناطيسي ضعيفة في الخلايا ، في الاتجاه المعاكس للمجال التطبيقي. وهكذا، إذا تم تعليق الخلايا في محلول مغناطيسي وعرضها لحقل مغناطيسي عمودي قوي، فإنها سوف ترتفع بعيدا عن المصدر المغناطيسي وتتوقف إلى ارتفاع، والذي يعتمد في المقام الأول على كثافتها الفردية. الارتفاع ثنائي المغناطيسي للجسم المحصور في الحد الأدنى من المجال المغناطيسي غير المتجانس ممكن عندما يتم استيفاء المعيارين التاليين: 1) يجب أن تكون الحساسية المغناطيسية للجسيمات أصغر من المتوسط المحيط ، و 2) يجب أن تكون القوة المغناطيسية قوية بما يكفي لموازنة قوة الطفو للجسيمات. ويمكن الوفاء بكلا المعيارين عن طريق تعليق RBCs في العازلة المغناطيسية وخلق تدرجات المجال المغناطيسي قوية مع مغناطيس دائم صغيرة وغير مكلفة ومتاحة تجاريا1. يتم تحديد موضع توازن جسيم محصور مغناطيسيا على محور على طول اتجاه الجاذبية من خلال كثافته (بالنسبة لكثافة العازلة) ، وقابليته المغناطيسية (بالنسبة للحساسية المغناطيسية للحاجز) ، وتوقيع المجال المغناطيسي التطبيقي. وبما أن الكثافة والخصائص المغناطيسية للمحلول ثابتة في جميع أنحاء النظام ، فإن خصائص الكثافة الجوهرية للخلايا ستكون العامل الرئيسي الذي يحدد ارتفاع ارتفاع الخلايا ، مع خلايا أكثر كثافة ترتفع أقل مقارنة بالخلايا الأقل كثافة. يستخدم هذا النهج مجموعة من حبات مرجعية ذات كثافة (1.05 و 1.2 غرام/مل) تسمح لنا باستخدام تحليل دقيق وقياسي لقياس الكثافة. تغيير تركيز المحلول المغناطيسي يسمح لأحد لعزل مجموعات مختلفة من الخلايا، مثل RBCs من WBCs، وكثافة الخلايا المتداولة هي خلية محددة، وإزالة الحاجة إلى بروتوكولات العزل أو التلاعب الخلية الأخرى.
تعتمد غالبية طرق الكشف المستخدمة في أبحاث البيولوجيا على استقراء أحداث ملزمة محددة في سهولة تحديد الإشارات الخطية. وغالبا ما تكون أساليب القراءة هذه معقدة وتنطوي على معدات متخصصة وموظفين علميين متفرغين. وصف نهج يهدف إلى الكشف عن المستضدات الموجودة إما على غشاء البلازما للخلايا أو الحويصلات خارج الخلية أو القابلة للذوبان في البلازما ، باستخدام حبة واحدة أو اثنتين من الأجسام المضادة المغلفة . يجب أن تكون الخرز ذات كثافات مختلفة عن بعضها البعض ومن تلك الخاصة بالأهداف التي تم استجوابها. يتم ترجمة وجود مستضد الهدف في أي سائل حيوي معين إلى تغيير محدد وقابل للقياس في ارتفاع الارتفاع لخلية إيجابية مستضد مرتبطة بالخرزة الكشفية. في حالة المستضدات القابلة للذوبان أو الحويصلات خارج الخلية ، فهي ملزمة بالتقاط والخرز والكشف عنه ، مما يشكل مجمع حبة حبة بدلا من مجمع خلايا الخرز. يعتمد التغيير في ارتفاع الارتفاع على الكثافة الجديدة لمجمعات خلية الخرز أو حبة الخرز. بالإضافة إلى التغير في ارتفاع الارتفاع للمجمعات ، مما يشير إلى وجود مستضد في السائل الحيوي ، يعتمد عدد المجمعات أيضا على مقدار الهدف ، مما يجعل الارتفاع المغناطيسي أيضا نهجا كميا للكشف عن المستضد24.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطارد المركزي المتدرجة حاليا تقنية قياسية لعزل المكونات دون الخلوية على أساس كثافات فريدة من نوعها. غير أن هذا النهج يتطلب استخدام وسائط متخصصة متدرجة ومعدات للطرد المركزي. يسمح نهج الارتفاع المغناطيسي المعروض هنا بإجراء تحقيق مفصل في الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا المتداولة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جيلوليو بيريرا على مساعدته في العمل خارج الخلية.
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح المعهد الوطني للصحة التالية إلى ICG: RO1CA218500 وUG3HL147353 وUG3TR002881.
Materials
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
- Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. Magnetically Levitated Plasma Proteins. Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).
- Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
- Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
- Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
- Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
- Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
- Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
- Grover, W. H., et al. Measuring single-cell density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).
- Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
- Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
- Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
- Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
- Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
- Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
- Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
- Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
- Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
- Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
- Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
- Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).
- Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
- Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
- Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
- Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).
