Quantifizierung zellulärer Dichten und antigener Eigenschaften mittels Magnetschwebebahn
Summary
Diese Arbeit beschreibt eine auf Magnetschwebenutzung basierende Methode, die spezifisch das Vorhandensein von Antigenen, entweder löslich oder membrangebunden, nachweisen kann, indem Änderungen der Levitationshöhe von Auffangperlen mit festen Dichten quantifiziert werden.
Abstract
Die beschriebene Methode wurde basierend auf den Prinzipien der Magnetschwebebahn entwickelt, die Zellen und Partikel anhand ihrer Dichte und magnetischen Eigenschaften trennt. Dichte ist eine Zelltyp-identifizierende Eigenschaft, die in direktem Zusammenhang mit seiner Stoffwechselrate, Differenzierung und seinem Aktivierungsstatus steht. Die Magnetschwebebahn ermöglicht einen einstufigen Ansatz zur erfolgreichen Trennung, Abbildung und Charakterisierung zirkulierender Blutzellen sowie zur Erkennung von Anämie, Sichelzellenanämie und zirkulierenden Tumorzellen basierend auf Dichte und magnetischen Eigenschaften. Dieser Ansatz ist auch für den Nachweis löslicher Antigene in einer Lösung geeignet, indem Sätze von Perlen niedriger und hoher Dichte verwendet werden, die mit Einfang- bzw. Nachweisantikörpern beschichtet sind. Wenn das Antigen in Lösung vorhanden ist, überbrückt es die beiden Sätze von Perlen und erzeugt einen neuen Perlen-Perlen-Komplex, der zwischen den Reihen der antikörperbeschichteten Perlen schwebt. Eine erhöhte Konzentration des Zielantigens in Lösung erzeugt im Vergleich zu niedrigeren Antigenkonzentrationen eine größere Anzahl von Perlen-Perlen-Komplexen, wodurch quantitative Messungen des Zielantigens ermöglicht werden. Die Magnetschwebebahn ist für andere Methoden aufgrund ihrer verkürzten Probenvorbereitungszeit und der fehlenden Abhängigkeit von klassischen Auslesemethoden vorteilhaft. Das erzeugte Bild kann einfach mit einem Standardmikroskop oder einem mobilen Gerät wie einem Smartphone oder einem Tablet erfasst und analysiert werden.
Introduction
Die Magnetschwebebahn ist eine Technik, die entwickelt wurde, um die Zelltypen1,2,3,Proteine4,5 und Opioide6 ausschließlich auf der Grundlage ihrer spezifischen Dichte und paramagnetischen Eigenschaften zu trennen, zu analysieren und zu identifizieren. Die Zelldichte ist eine einzigartige, intrinsische Eigenschaft jedes Zelltyps, die in direktem Zusammenhang mit seiner Stoffwechselrate und seinem Differenzierungsstatus steht7,8,9,10,11,12,13,14. Die Quantifizierung subtiler und vorübergehender Veränderungen der Zelldichte unter stationären Bedingungen und während einer Vielzahl von Zellprozessen könnte einen unübertroffenen Einblick in die Zellphysiologie und Pathophysiologie ermöglichen. Veränderungen der Zelldichte sind mit der Zelldifferenzierung15,16, der Zellzyklusprogression9,17,18,19, apoptose20,21,22,23und der malignen Transformation24,25,26 verbunden . Daher kann die Quantifizierung spezifischer Änderungen der Zelldichte verwendet werden, um zwischen Zellen verschiedener Typen zu unterscheiden und zwischen demselben Zelltyp zu unterscheiden, der verschiedenen Aktivierungsprozessen unterzogen wird. Dies ermöglicht Experimente, die auf eine bestimmte Zellteilpopulation abzielen, wobei dynamische Dichteänderungen als Indikator für einen veränderten Zellstoffwechsel dienen27. Da festgestellt wurde, dass eine Zelle ihre Dichte als Reaktion auf eine sich ändernde Umgebung ändern kann7, ist es unerlässlich, die Kinetik der Zelle in Bezug auf ihre Dichte zu messen, um sie vollständig zu verstehen, was aktuelle Methoden möglicherweise nicht liefern12. Die Magnetschwebebahn hingegen ermöglicht eine dynamische Bewertung von Zellen und ihren Eigenschaften28.
Zellen sind diamagnetisch, was bedeutet, dass sie kein permanentes magnetisches Dipolmoment haben. Wenn es jedoch einem externen Magnetfeld ausgesetzt wird, wird in den Zellen ein schwaches magnetisches Dipolmoment in der entgegengesetzten Richtung des angelegten Feldes erzeugt. Wenn Zellen also in einer paramagnetischen Lösung suspendiert und einem starken vertikalen Magnetfeld ausgesetzt werden, schweben sie von der Magnetquelle weg und stoppen bis zu einer Höhe, die in erster Linie von ihrer individuellen Dichte abhängt. Die diamagnetische Levitation eines Objekts, das auf das Minimum eines inhomogenen Magnetfeldes beschränkt ist, ist möglich, wenn die beiden folgenden Kriterien erfüllt sind: 1) Die magnetische Anfälligkeit des Partikels muss kleiner sein als die des umgebenden Mediums und 2) die Magnetkraft muss stark genug sein, um die Auftriebskraft des Partikels auszugleichen. Beide Kriterien können erfüllt werden, indem Erythrozyten in einem magnetischen Puffer aufgehängt und starke Magnetfeldgradienten mit kleinen, kostengünstigen, handelsüblichen Permanentmagneten erzeugt werden1. Die Gleichgewichtsposition eines magnetisch gefangenen Teilchens auf einer Achse entlang der Gravitationsrichtung wird durch seine Dichte (relativ zur Dichte des Puffers), seine magnetische Anfälligkeit (relativ zur magnetischen Empfindlichkeit des Puffers) und die Signatur des angelegten Magnetfeldes bestimmt. Da die Dichte und die magnetischen Eigenschaften der Lösung im gesamten System konstant sind, sind die intrinsischen Dichteeigenschaften der Zellen der Hauptfaktor, der die Levitationshöhe der Zellen bestimmt, wobei dichtere Zellen im Vergleich zu weniger dichten Zellen niedriger schweben. Dieser Ansatz verwendet einen Satz von zwei Dichtereferenzperlen (1,05 und 1,2 g/ ml), die es uns ermöglichen, eine präzise, ratiometrische Analyse für Dichtemessungen zu verwenden. Die Änderung der Konzentration der magnetischen Lösung ermöglicht es, verschiedene Zelluläre Populationen wie Erythrozyten von WBCs zu isolieren, da die Dichte der zirkulierenden Zellen zellspezifisch ist, wodurch isolationsprotokolle oder andere Zellmanipulationen entfallen.
Die Mehrzahl der in der biologischen Forschung verwendeten Nachweismethoden beruht auf der Extrapolation spezifischer Bindungsereignisse in leicht zu quantifizierende lineare Signale. Diese Auslesemethoden sind oft komplex und erfordern spezielle Geräte und engagiertes wissenschaftliches Personal. Ein Ansatz, der auf den Nachweis von Antigenen abzielt, die entweder auf der Plasmamembran von Zellen oder extrazellulären Vesikeln gefunden werden oder die im Plasma löslich sind, wobei entweder eine oder zwei Antikörperbeschichtete Kügelchen verwendet werden, wird hierin beschrieben. Die Perlen müssen von unterschiedlicher Dichte sein als die voneinander und von denen der befragten Ziele. Das Vorhandensein des Zielantigens in einem bestimmten Biofluid wird in eine spezifische, messbare Änderung der Levitationshöhe einer Antigen-positiven Zelle übersetzt, die an eine Nachweisperle gebunden ist. Im Falle von löslichen Antigenen oder extrazellulären Vesikeln sind sie sowohl an Einfang- als auch an Nachweisperlen gebunden und bilden eher einen Perlen-Perlen-Komplex als einen Perlen-Zell-Komplex. Die Änderung der Levitationshöhe hängt von der neuen Dichte der Perlenzell- oder Perlen-Perlen-Komplexe ab. Neben der Änderung der Levitationshöhe der Komplexe, die auf das Vorhandensein von Antigen im Biofluid hinweist, hängt die Anzahl der Komplexe auch von der Menge des Ziels ab, was die Magnetschwebebahn auch zu einem quantitativen Ansatz für den Antigennachweis macht24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Gradientenzentrifugation ist derzeit die Standardtechnik zur Isolierung subzellulärer Komponenten aufgrund ihrer einzigartigen Dichten. Dieser Ansatz erfordert jedoch den Einsatz spezialisierter Gradientenmedien sowie Zentrifugenanlagen. Der hier vorgestellte Magnetschwebeansatz ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der morphologischen und funktionellen Eigenschaften zirkulierender Zellen mit minimaler, wenn überhaupt, Manipulation der Zellen, was einen nahezu in vivo-Zugang zu zirkulierenden Zellen e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Getulio Pereira für seine Hilfe bei der extrazellulären Vesikelarbeit.
Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschüsse des National Institute of Health an ICG unterstützt: RO1CA218500, UG3HL147353 und UG3TR002881.
Materials
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
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