Cet article décrit une méthode basée sur la lévitation magnétique qui peut détecter spécifiquement la présence d’antigènes, solubles ou liés à la membrane, en quantifiant les changements dans la hauteur de lévitation des billes de capture avec des densités fixes.
La méthode décrite a été développée sur la base des principes de la lévitation magnétique, qui sépare les cellules et les particules en fonction de leur densité et de leurs propriétés magnétiques. La densité est une propriété d’identification de type cellulaire, directement liée à son taux métabolique, à sa différenciation et à son statut d’activation. La lévitation magnétique permet une approche en une étape pour séparer, imager et caractériser avec succès les cellules sanguines circulantes, et pour détecter l’anémie, la drépanocytose et les cellules tumorales circulantes en fonction de la densité et des propriétés magnétiques. Cette approche se prête également à la détection d’antigènes solubles présents dans une solution en utilisant des ensembles de billes de faible et haute densité recouvertes d’anticorps de capture et de détection, respectivement. Si l’antigène est présent en solution, il reliera les deux ensembles de perles, générant un nouveau complexe perle-perle, qui lévitera entre les rangées de perles recouvertes d’anticorps. Une concentration accrue de l’antigène cible en solution générera un plus grand nombre de complexes perles-billes par rapport à des concentrations plus faibles d’antigène, permettant ainsi des mesures quantitatives de l’antigène cible. La lévitation magnétique est avantageuse pour d’autres méthodes en raison de son temps de préparation des échantillons réduit et de son manque de dépendance aux méthodes de lecture classiques. L’image générée est facilement capturée et analysée à l’aide d’un microscope standard ou d’un appareil mobile, tel qu’un smartphone ou une tablette.
La lévitation magnétique est une technique développée pour séparer, analyser et identifier les types de cellules1,2,3,protéines4,5 et opioïdes6 en fonction uniquement de leur densité spécifique et de leurs propriétés paramagnétiques. La densité cellulaire est une propriété intrinsèque unique de chaque type de cellule directement liée à son taux métabolique et à son statut de différenciation7,8,9,10,11,12,13,14. La quantification des changements subtils et transitoires de la densité cellulaire dans des conditions d’état d’équilibre et au cours de divers processus cellulaires pourrait permettre de mieux comprendre la physiologie et la physiopathologie cellulaires. Les changements de densité cellulaire sont associés à la différenciation cellulaire15,16, la progression du cycle cellulaire9,17,18,19, l’apoptose20,21,22,23, et la transformation maligne24,25,26 . Par conséquent, la quantification de changements spécifiques dans la densité cellulaire peut être utilisée pour différencier les cellules de différents types, ainsi que pour discriminer le même type de cellules subissant divers processus d’activation. Cela permet des expériences qui ciblent une sous-population cellulaire particulière, où les changements dynamiques de densité servent d’indicateur d’altération du métabolisme cellulaire27. Comme il a été établi qu’une cellule peut altérer sa densité en réponse à un environnement changeant7,il est impératif de mesurer la cinétique de la cellule par rapport à sa densité pour la comprendre pleinement, ce que les méthodes actuelles peuvent ne pas fournir12. La lévitation magnétique, quant à elle, permet une évaluation dynamique des cellules et de leurs propriétés28.
Les cellules sont diamagnétiques, ce qui signifie qu’elles n’ont pas de moment dipolaire magnétique permanent. Cependant, lorsqu’il est exposé à un champ magnétique externe, un faible moment dipolaire magnétique est généré dans les cellules, dans la direction opposée du champ appliqué. Ainsi, si les cellules sont suspendues dans une solution paramagnétique et exposées à un fort champ magnétique vertical, elles léviteront loin de la source magnétique et s’arrêteront à une hauteur, qui dépend principalement de leur densité individuelle. La lévitation diamagnétique d’un objet confiné au minimum d’un champ magnétique inhomogène est possible lorsque les deux critères suivants sont remplis : 1) la susceptibilité magnétique de la particule doit être inférieure à celle du milieu environnant, et 2) la force magnétique doit être suffisamment forte pour contrebalancer la force de flottabilité de la particule. Les deux critères peuvent être remplis en suspendant les globules bouclés dans un tampon magnétique et en créant de forts gradients de champ magnétique avec de petits aimants permanents peu coûteux et disponibles dans le commerce1. La position d’équilibre d’une particule piégée magnétiquement sur un axe le long de la direction de la gravité est déterminée par sa densité (par rapport à la densité du tampon), sa susceptibilité magnétique (par rapport à la susceptibilité magnétique du tampon) et la signature du champ magnétique appliqué. Comme la densité et les propriétés magnétiques de la solution sont constantes dans tout le système, les propriétés de densité intrinsèque des cellules seront le principal facteur déterminant la hauteur de lévitation des cellules, les cellules plus denses lévitant moins que les cellules moins denses. Cette approche utilise un ensemble de deux billes de référence de densité (1,05 et 1,2 g/mL) qui nous permettent d’utiliser une analyse ratiométrique précise pour les mesures de densité. La modification de la concentration de la solution magnétique permet d’isoler différentes populations cellulaires, telles que les globules rouges des globules blancs, car la densité des cellules circulantes est spécifique à la cellule, éliminant ainsi le besoin de protocoles d’isolement ou d’autres manipulations cellulaires.
La majorité des méthodes de détection utilisées dans la recherche en biologie reposent sur l’extrapolation d’événements de liaison spécifiques en signaux linéaires faciles à quantifier. Ces méthodes de lecture sont souvent complexes et impliquent un équipement spécialisé et un personnel scientifique dédié. Une approche visant à la détection d’antigènes présents soit sur la membrane plasmique de cellules ou de vésicules extracellulaires, soit solubles dans le plasma, à l’aide d’une ou deux billes recouvertes d’anticorps, est décrite ici. Les perles doivent être de densités différentes les unes des autres et de celles des cibles interrogées. La présence de l’antigène cible dans un biofluide donné se traduit par un changement spécifique et mesurable de la hauteur de lévitation d’une cellule antigène positif liée à une bille de détection. Dans le cas d’antigènes solubles ou de vésicules extracellulaires, ils sont liés à la fois aux perles de capture et de détection, formant un complexe perle-perle plutôt qu’un complexe perle-cellule. Le changement de hauteur de lévitation dépend de la nouvelle densité des complexes perles-cellules ou perles-perles. Outre la modification de la hauteur de lévitation des complexes, qui indique la présence d’antigène dans le biofluide, le nombre de complexes dépend également de la quantité de cible, ce qui fait de la lévitation magnétique également une approche quantitative pour la détection d’antigènes24.
La centrifugation par gradient est actuellement la technique standard pour isoler les composants subcellulaires en fonction de leurs densités uniques. Cette approche nécessite toutefois l’utilisation de milieux de gradient spécialisés ainsi que d’équipements de centrifugeuse. L’approche de lévitation magnétique présentée ici permet une étude détaillée des propriétés morphologiques et fonctionnelles des cellules circulantes, avec un minimum, voire aucune manipulation des cellules, fournissant un accès…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Getulio Pereira pour son aide dans le travail sur les vésicules extracellulaires.
Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes de l’Institut national de la santé à iCG: RO1CA218500, UG3HL147353 et UG3TR002881.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |