Manyetik Levitasyon Kullanılarak Hücresel Yoğunlukların ve Antijenik Özelliklerin Nicelleştirilmesi
Summary
Bu makalede, sabit yoğunluklu yakalama boncuklarının kaldırma yüksekliğindeki değişiklikleri ölçerek çözünür veya zara bağlı antijenlerin varlığını özellikle tespit edebilen manyetik kaldırma tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Açıklanan yöntem, hücreleri ve parçacıkları yoğunluklarına ve manyetik özelliklerine göre ayıran manyetik yükselme ilkelerine dayanarak geliştirilmiştir. Yoğunluk, metabolik hızı, farklılaşması ve aktivasyon durumuyla doğrudan ilişkili bir hücre türü tanımlama özelliğidir. Manyetik yükselme, dolaşımdaki kan hücrelerini başarıyla ayırmak, görüntünü ve karakterize etmek ve anemiyi, orak hücre hastalığını ve dolaşımdaki tümör hücrelerini yoğunluk ve manyetik özelliklere göre tespit etmek için tek adımlı bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşım, sırasıyla yakalama ve algılama antikorları ile kaplanmış düşük ve yüksek yoğunluklu boncuk setleri kullanarak bir çözeltide bulunan çözünür antijenleri tespit etmeye de elverişlidir. Antijen çözeltide mevcutsa, iki boncuk kümesini köprüleyecek ve antikor kaplı boncuk sıraları arasında kabaracak yeni bir boncuk boncuk kompleksi üretecektir. Çözeltideki hedef antijenin artan konsantrasyonu, daha düşük antijen konsantrasyonlarına kıyasla daha fazla sayıda boncuk-boncuk kompleksi üretecek ve böylece hedef antijenin nicel ölçümlerine izin verecektir. Manyetik yükselme, azalan numune hazırlama süresi ve klasik okuma yöntemlerine olan bağlı olmaması nedeniyle diğer yöntemlere göre avantajlıdır. Oluşturulan görüntü, akıllı telefon veya tablet gibi standart bir mikroskop veya mobil cihaz kullanılarak kolayca yakalanır ve analiz edilir.
Introduction
Manyetik yükselme, hücre tipleri 1 ,2, 3,proteinler4,5ve opioid6’yı sadece spesifik yoğunluklarına ve paramanyetik özelliklerine göreayırmak, analiz etmek ve tanımlamak için geliştirilmiş bir tekniktir. Hücre yoğunluğu, metabolik hızı ve farklılaşma durumu 7 , 8 ,9, 10 , 11,12,13,14ile doğrudan ilişkili her hücre tipininbenzersiz,içsel bir özelliğidir. Sabit durum koşullarında ve çeşitli hücre süreçlerinde hücre yoğunluğundaki ince ve geçici değişiklikleri ölçmek, hücre fizyolojisi ve patofizyolojisi hakkında eşsiz bir içgörü sağlayabilir. Hücre yoğunluğundaki değişiklikler hücre farklılaşması15,16, hücre döngüsü ilerlemesi 9 ,17,18,19,apoptoz 20 ,21,22,23ve kötü huylu dönüşüm24 , 25,26 ileilişkilidir. . Bu nedenle, hücre yoğunluğundaki belirli değişikliklerin nicelemesi, farklı türdeki hücreler arasında ayrım yapmak ve çeşitli aktivasyon işlemlerinden geçen aynı hücre türleri arasında ayrım yapmak için kullanılabilir. Bu, yoğunluktaki dinamik değişikliklerin değiştirilmiş hücre metabolizmasının bir göstergesi olarak hizmet ettiği belirli bir hücre alt popülasyonu hedefleyen deneylere olanak tanır27. Bir hücrenin değişen bir ortama yanıt olarak yoğunluğunu değiştirebileceği tespit edildiği için7, hücrenin kinetiğini tam olarak anlamak için yoğunluğuna göre ölçmek zorunludur, hangi mevcut yöntemler12sağlamayabilir. Öte yandan manyetik yükselme, hücrelerin ve özelliklerinin dinamik bir şekilde değerlendirilmesini sağlar28.
Hücreler diamanyetiktir, yani kalıcı bir manyetik dipol momenti olmazlar. Bununla birlikte, harici bir manyetik alana maruz kaldığında, hücrelerde uygulanan alanın tersi yönde zayıf bir manyetik dipol momenti oluşur. Böylece, hücreler paramanyetik bir çözeltide askıya alınır ve güçlü bir dikey manyetik alana maruz kalırsa, manyetik kaynaktan uzaklaşır ve öncelikle bireysel yoğunluklarına bağlı olarak bir yüksekliğe dururlar. Aşağıdaki iki kriter yerine getirildiğinde, en az sayıdaki bir inhomogeneous manyetik alanla sınırlı bir nesnenin diamanyetik olarak yükselmesi mümkündür: 1) parçacığın manyetik duyarlılığı çevredeki ortamınkinden daha küçük olmalı ve 2) manyetik kuvvet, parçacığın yüzdürme kuvvetini dengelemek için yeterince güçlü olmalıdır. Her iki kriter de RBI’ların manyetik bir tamponda askıya alınması ve küçük, ucuz, piyasada bulunan kalıcı mıknatıslarla güçlü manyetik alan gradyanları oluşturularak yerine getirilebilir1. Manyetik olarak sıkışmış bir parçacığın yerçekimi yönü boyunca bir eksen üzerindeki dengesi, yoğunluğu (tamponun yoğunluğuna göre), manyetik duyarlılığı (tamponun manyetik duyarlılığına göre) ve uygulanan manyetik alanın imzası ile belirlenir. Çözeltinin yoğunluğu ve manyetik özellikleri sistem genelinde sabit olduğundan, hücrelerin iç yoğunluk özellikleri, hücrelerin yükselme yüksekliğini belirleyen ana faktör olacaktır, daha yoğun hücreler daha az yoğun hücrelere kıyasla daha düşük yükselir. Bu yaklaşım, yoğunluk ölçümleri için hassas, oranmetrik analiz kullanmamızı sağlayan iki yoğunluk referans boncuk seti (1,05 ve 1,2 g/mL) kullanır. Manyetik çözeltinin konsantrasyonunun değiştirilmesi, dolaşımdaki hücrelerin yoğunluğu hücreye özgü olduğundan, RBI’lar gibi farklı hücresel popülasyonları WBC’lerden izole etmeyi sağlar, bu da izolasyon protokollerine veya diğer hücre manipülasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırır.
Biyoloji araştırmalarında kullanılan algılama yöntemlerinin çoğu, doğrusal sinyallerin ölçülmesi kolay hale gelen belirli bağlama olaylarının tahmin edilmesine dayanır. Bu okuma yöntemleri genellikle karmaşıktır ve özel ekipman ve özel bilimsel personel içerir. Hücrelerin plazma zarında veya hücre dışı vezikliklerde bulunan veya plazmada çözünebilen antijenlerin bir veya iki antikor kaplı boncuk kullanılarak tespitini amaçlayan bir yaklaşım burada açıklanmıştır. Boncuklar birbirinden ve sorgulanan hedeflerinkinden farklı yoğunluklarda olmalıdır. Herhangi bir biyofluidde hedef antijenin varlığı, bir algılama parçasına bağlı bir antijen pozitif hücrenin yükselme yüksekliğinde belirli, ölçülebilir bir değişikliğe çevrilir. Çözünür antijenler veya hücre dışı veziklinler durumunda, boncuk hücre kompleksi yerine boncuk-boncuk kompleksi oluşturan boncukları hem yakalama hem de algılamaya bağlıdırlar. Yükselme yüksekliğindeki değişiklik boncuk hücre veya boncuk-boncuk komplekslerinin yeni yoğunluğuna bağlıdır. Komplekslerin yükselme yüksekliğindeki değişikliğe ek olarak, biyofluidde antijen varlığını gösteren, komplekslerin sayısı da hedef miktarına bağlıdır, bu da manyetik yükselmeyi antijen tespiti için nicel bir yaklaşım24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Degrade santrifüjleme şu anda hücre altı bileşenleri benzersiz yoğunluklarına göre izole etmek için standart tekniktir. Ancak bu yaklaşım, özel degrade ortamın yanı sıra santrifüj ekipmanının kullanılmasını gerektirir. Burada sunulan manyetik yükselme yaklaşımı, dolaşımdaki hücrelerin morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin ayrıntılı bir şekilde araştırılmasına izin verir, minimum, hücrelerin herhangi bir manipülasyonu durumunda, dolaşımdaki hücrelere yakın bir in vivo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, dr. Getulio Pereira’ya hücre dışı vezne çalışmalarındaki yardımları için teşekkür eder.
Bu çalışma ICG’ye aşağıdaki Ulusal Sağlık Enstitüsü hibeleri tarafından desteklendi: RO1CA218500, UG3HL147353 ve UG3TR002881.
Materials
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
- Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. Magnetically Levitated Plasma Proteins. Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).
- Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
- Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
- Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
- Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
- Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
- Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
- Grover, W. H., et al. Measuring single-cell density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).
- Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
- Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
- Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
- Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
- Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
- Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
- Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
- Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
- Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
- Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
- Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
- Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).
- Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
- Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
- Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
- Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).
