Kvantifiering av cellulär densitet och antigena egenskaper med hjälp av magnetisk levitation
Summary
Detta dokument beskriver en magnetisk levitation-baserad metod som specifikt kan upptäcka förekomsten av antigener, antingen lösliga eller membranbundna, genom att kvantifiera förändringar i levitationshöjden för fångstpärlor med fasta densiteter.
Abstract
Den beskrivna metoden utvecklades utifrån principerna för magnetisk levitation, som separerar celler och partiklar baserat på deras densitet och magnetiska egenskaper. Densitet är en celltyp som identifierar egenskap, direkt relaterad till dess ämnesomsättning, differentiering och aktiveringsstatus. Magnetisk levitation möjliggör en ettstegsmetod för att framgångsrikt separera, avbilda och karakterisera cirkulerande blodkroppar och för att upptäcka anemi, sicklecellsjukdom och cirkulerande tumörceller baserat på densitet och magnetiska egenskaper. Detta tillvägagångssätt är också mottagligt för att upptäcka lösliga antigener som finns i en lösning genom att använda uppsättningar av låg- och högdensitet pärlor belagda med fångst och detektion antikroppar, respektive. Om antigenet finns i lösning, kommer det att överbrygga de två uppsättningarna pärlor, vilket genererar ett nytt pärlpärlorkomplex, som kommer att levitera mellan raderna av antikroppsbelagda pärlor. Ökad koncentration av målantigenet i lösningen kommer att generera ett större antal pärlpärlakomplex jämfört med lägre koncentrationer av antigen, vilket möjliggör kvantitativa mätningar av målantigenet. Magnetisk levitation är fördelaktig för andra metoder på grund av dess minskade provberedningstid och brist på beroende av klassiska avläsningsmetoder. Bilden som genereras fångas och analyseras enkelt med hjälp av ett standardmikroskop eller mobil enhet, till exempel en smartphone eller en surfplatta.
Introduction
Magnetisk levitation är en teknik som utvecklats för att separera, analysera och identifiera celltyper1,2,3, proteiner4,5 och opioider6 baserat enbart på deras specifika densitet och paramagnetiska egenskaper. Celltäthet är en unik, inneboende egenskap hos varje celltyp som är direkt relaterad till dess ämnesomsättning och differentieringsstatus7,8,9,10,11,12,13,14. Kvantifiering av subtila och övergående förändringar i celltäthet under steady state förhållanden, och under en mängd olika cellprocesser, kan ge en oöverträffad inblick i cellfysiologi och patofysiologi. Förändringar i celltätheten är förknippade med celldifferentiering15,16, cellcykelprogression9,17,18,19, apoptos20,21,22,23och malign omvandling24,25,26 . Därför kan kvantifiering av specifika förändringar i celltätheten användas för att skilja mellan celler av olika typer, samt diskriminera mellan samma typ av celler som genomgår olika aktiveringsprocesser. Detta möjliggör experiment som riktar sig till en viss cellunderpopulation, där dynamiska förändringar i densitet fungerar som en indikator på förändrad cellmetabolism27. Eftersom det har fastställts att en cell kan ändra sin densitet som svar på en föränderlig miljö7, är det absolut nödvändigt att mäta cellens kinetik i förhållande till dess densitet för att förstå den fullt ut, vilka nuvarande metoder kanske inte ger12. Magnetisk levitation å andra sidan möjliggör en dynamisk utvärdering av celler och deras egenskaper28.
Celler är diamagnetiska vilket innebär att de inte har ett permanent magnetiskt dipolmoment. Men när det utsätts för ett externt magnetfält genereras ett svagt magnetiskt dipolmoment i cellerna, i motsatt riktning mot det applicerade fältet. Således, om celler är upphängda i en paramagnetisk lösning och utsätts för ett starkt vertikalt magnetfält, kommer de att sväva bort från den magnetiska källan och stanna till en höjd, vilket främst beror på deras individuella densitet. Diamagnetisk levitation av ett objekt som är begränsat till ett minimum av ett inhomogent magnetfält är möjligt när de två följande kriterierna är uppfyllda: 1) partikelns magnetiska känslighet måste vara mindre än det omgivande mediets, och 2) den magnetiska kraften måste vara tillräckligt stark för att balansera partikelns flytkraft. Båda kriterierna kan uppfyllas genom att suspendera RBC i en magnetisk buffert och genom att skapa starka magnetiska fältgradienter med små, billiga, kommersiellt tillgängliga permanenta magneter1. Jämviktspositionen för en magnetiskt instängd partikel på en axel längs gravitationsriktningen bestäms av dess densitet (i förhållande till buffertens densitet), dess magnetiska känslighet (i förhållande till buffertens magnetiska känslighet) och signaturen för det applicerade magnetfältet. Eftersom lösningens densitet och magnetiska egenskaper är konstanta i hela systemet, kommer cellernas inneboende densitetsegenskaper att vara den viktigaste faktorn som bestämmer cellernas levitationshöjd, med tätare celler som svävar lägre jämfört med mindre täta celler. Detta tillvägagångssätt använder en uppsättning av två densitetsreferenspärlor (1,05 och 1,2 g/ml) som gör att vi kan använda exakt, ratiometrisk analys för densitetsmätningar. Genom att ändra koncentrationen av den magnetiska lösningen kan man isolera olika cellulära populationer, såsom RBC från WBC, eftersom densiteten hos cirkulerande celler är cellspecifik, vilket tar bort behovet av isoleringsprotokoll eller annan cellmanipulation.
Majoriteten av de detektionsmetoder som används inom biologiforskningen bygger på extrapolering av specifika bindande händelser till lätt att kvantifiera linjära signaler. Dessa avläsningsmetoder är ofta komplexa och involverar specialiserad utrustning och dedikerad vetenskaplig personal. Ett tillvägagångssätt som syftar till påvisande av antigener som finns antingen på plasmamembranet i celler eller extracellulära blåsor eller som är lösliga i plasma, med antingen en eller två antikroppsbelagda pärlor, beskrivs häri. Pärlorna måste vara av olika densitet från varandra och från de förhörda målen. Förekomsten av målantigenet i ett givet biofluid översätts till en specifik, mätbar förändring av levitationshöjden hos en antigenpositiv cell som är bunden till en detektionspärla. När det gäller lösliga antigener eller extracellulära blåsor är de bundna till både fångst- och detektionspärlor och bildar ett pärlpärlorkomplex snarare än pärlcellskomplex. Förändringen i levitationshöjd beror på den nya densiteten hos pärlcells- eller pärlpärlakomplexen. Förutom förändringen i levitationshöjden på komplexen, vilket indikerar närvaron av antigen i biofluiden, är antalet komplex också beroende av mängden mål, vilket gör magnetisk levitation också till ett kvantitativt tillvägagångssätt för antigendetektering24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gradientcentrifugering är för närvarande standardtekniken för att isolera subcellulära komponenter baserat på deras unika densitet. Detta tillvägagångssätt kräver dock användning av specialiserade gradientmedier samt centrifugutrustning. Den magnetiska levitationsmetoden som presenteras här möjliggör detaljerad undersökning av de morfologiska och funktionella egenskaperna hos cirkulerande celler, med minsta, om någon manipulering av cellerna, vilket ger en nära in vivo tillgång till cirkulerand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr. Getulio Pereira för hans hjälp med extracellulärt vesikelarbete.
Detta arbete stöddes av följande nationella hälsobidrag till ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 och UG3TR002881.
Materials
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
References
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
- Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. Magnetically Levitated Plasma Proteins. Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).
- Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
- Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
- Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
- Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
- Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
- Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
- Grover, W. H., et al. Measuring single-cell density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).
- Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
- Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
- Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
- Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
- Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
- Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
- Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
- Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
- Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
- Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
- Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
- Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).
- Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
- Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
- Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
- Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).
