Voorbereiding van menselijke weefsels ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding voor massaspectrometrie-analyse
Summary
Sfingolipiden zijn bioactieve metabolieten met gevestigde rollen bij menselijke ziekten. Het karakteriseren van veranderingen in weefsels met massaspectrometrie kan rollen in de ziekte-etiologie onthullen of therapeutische doelen identificeren. De OCT-verbinding die wordt gebruikt voor cryopreservatie in biorepositories interfereert echter met massaspectrometrie. We schetsen methoden om sfingolipiden in menselijke weefsels ingebed in OCT te analyseren met LC-ESI-MS / MS.
Abstract
Sfingolipiden zijn cellulaire componenten die een gevestigde rol spelen in het menselijk metabolisme en ziekte. Massaspectrometrie kan worden gebruikt om te bepalen of sfingolipiden zijn veranderd in een ziekte en om te onderzoeken of sfingolipiden klinisch kunnen worden gericht. Goed aangedreven prospectieve studies die weefsels rechtstreeks uit de chirurgische suite verkrijgen, kunnen echter tijdrovend en technisch, logistiek en administratief uitdagend zijn. Retrospectieve studies kunnen daarentegen profiteren van gecryopreserveerde menselijke monsters die al beschikbaar zijn, meestal in grote aantallen, bij weefselbiorepositories. Andere voordelen van het verkrijgen van weefsels uit biorepositories zijn toegang tot informatie die verband houdt met de weefselmonsters, waaronder histologie, pathologie en in sommige gevallen clinicopathologische variabelen, die allemaal kunnen worden gebruikt om correlaties met lipidomics-gegevens te onderzoeken. Technische beperkingen met betrekking tot de incompatibiliteit van optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) die wordt gebruikt in de cryopreservatie en massaspectrometrie is echter een technische barrière voor de analyse van lipiden. We hebben echter eerder aangetoond dat OCT gemakkelijk kan worden verwijderd uit menselijke biorepository specimens door cycli van wasbeurten en centrifugatie zonder hun sfingolipidegehalte te veranderen. We hebben ook eerder vastgesteld dat sfingolipiden in menselijke weefsels die in OCT zijn gecryopreserveerd, tot 16 jaar stabiel zijn. In dit rapport schetsen we de stappen en workflow voor het analyseren van sfingolipiden in menselijke weefselmonsters die zijn ingebed in OCT, waaronder het wassen van weefsels, het wegen van weefsels voor gegevensnormalisatie, de extractie van lipiden, voorbereiding van monsters voor analyse door vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS / MS), massaspectrometrie data-integratie, gegevensnormalisatie en gegevensanalyse.
Introduction
Sfingolipiden zijn bioactieve metabolieten die bekend staan om hun rol in het menselijk metabolisme en ziekte 1,2. Ze reguleren complexe cellulaire processen zoals celmigratie, celoverleving en -dood, celbeweging, vesiculaire handel, cellulaire invasie en metastase, angiogenese en de productie van cytokines 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defecten in de regulatie van het sfingolipidemetabolisme dragen bij aan de initiatie en progressie van kankers, bepalen hoe agressief kankers zijn en hoe kankers reageren op en resistentie ontwikkelen tegen therapie 3,10. Daarom zijn, vanwege deze brede effecten op de etiologie van ziekten, analytische methoden die ziektespecifieke sfingolipideveranderingen nauwkeurig kunnen vaststellen, belangrijke hulpmiddelen. Massaspectrometrie (MS) is de meest nauwkeurige en betrouwbare methode om sfingolipideveranderingen te analyseren.
Menselijke specimens die kunnen worden gebruikt voor de analyse van sfingolipideveranderingen kunnen prospectief worden verkregen uit de chirurgische suite of retrospectief uit weefselbiorepositories. Verse weefsels van een operatie zijn voordelig omdat ze direct kunnen worden geanalyseerd door MS of andere analytische methoden. Het prospectief verkrijgen van weefsels heeft echter administratieve, technische en logistieke hindernissen en het verzamelen van voldoende exemplaren om statistische kracht te bereiken, kan een uitdaging zijn. Het verkrijgen van weefsels uit biorepositories is voordelig omdat ze retrospectief kunnen worden verkregen, in grote aantallen, en biorepositories bevestigen histologie en pathologie, standaard operationele procedures gebruiken om weefsels cryogenisch te bewaren en op te slaan, en kunnen clinicopathologische gegevens opleveren die kunnen worden gebruikt voor correlatieanalyses. Om moleculaire en structurele kenmerken te behouden, kunnen biorepositories echter weefsels cryopreserveren door ze in te bedden in een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT), waarvan we hebben aangetoond dat het interfereert met gegevensnormalisatietests en de kwantificering van sfingolipiden door vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS / MS)11 . Het is ook aangetoond dat polyvinylalcohol en polyethyleenglycol, de primaire componenten in OCT-verbinding, resulteren in ionenonderdrukking in andere MS-analyseplatforms 12,13,14,15. Daarom moet de OCT-verbinding uit weefsels worden verwijderd voorafgaand aan sfingolipidomische analyse door MS.
In een eerder rapport hebben we een protocol gevalideerd voor de verwijdering van OCT-verbindingen uit menselijke specimens voor LC-ESI-MS / MS-analyse11 en de methodologie die wordt gebruikt voor het wegen van weefsels voor gegevensnormalisatie11. Hier beschrijven we de stappen van het sfingolipidomic OCT compound-removal protocol (sOCTrP) en tonen we representatieve gegevens van menselijke longadenocarcinoomtumoren en normale aangrenzende niet-betrokken weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT is een veel voorkomend cryoconserveringsmiddel op lange termijn dat wordt gebruikt in biorepositories. OCT kan echter resulteren in ionenonderdrukking wanneer weefsels worden geanalyseerd door verschillende massaspectrometrieplatforms 12,13,14,15, of resulteren in signaalverlies wanneer monsters worden geanalyseerd door LC-ESI-MS / MS 11. OCT in gecryopreserveerde we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diensten en ondersteuning van het onderzoeksproject werden geleverd door de VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core en de VCU Lipidomics en Metabolomics Core, die gedeeltelijk worden ondersteund door financiering van NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. . Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
