Preparazione di tessuti umani incorporati in un composto di temperatura di taglio ottimale per l'analisi della spettrometria di massa
Summary
Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi con ruoli ben consolidati nelle malattie umane. La caratterizzazione delle alterazioni nei tessuti con spettrometria di massa può rivelare ruoli nell’eziologia della malattia o identificare bersagli terapeutici. Tuttavia, il composto OCT utilizzato per la crioconservazione nei biodepositi interferisce con la spettrometria di massa. Descriviamo metodi per analizzare gli sfingolipidi nei tessuti umani incorporati nell’OCT con LC-ESI-MS / MS.
Abstract
Gli sfingolipidi sono componenti cellulari che hanno ruoli ben consolidati nel metabolismo umano e nella malattia. La spettrometria di massa può essere utilizzata per determinare se gli sfingolipidi sono alterati in una malattia e indagare se gli sfingolipidi possono essere mirati clinicamente. Tuttavia, studi prospettici adeguatamente alimentati che acquisiscono tessuti direttamente dalla suite chirurgica possono richiedere molto tempo e impegnativi dal punto di vista tecnico, logistico e amministrativo. Al contrario, gli studi retrospettivi possono trarre vantaggio da campioni umani crioconservati già disponibili, di solito in gran numero, presso i biodepositi tissutali. Altri vantaggi dell’approvvigionamento di tessuti da biorepository includono l’accesso alle informazioni associate ai campioni di tessuto, tra cui istologia, patologia e in alcuni casi variabili clinicopatologiche, che possono essere utilizzate per esaminare le correlazioni con i dati lipidomici. Tuttavia, le limitazioni tecniche legate all’incompatibilità del composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) utilizzato nella crioconservazione e nella spettrometria di massa rappresentano un ostacolo tecnico per l’analisi dei lipidi. Tuttavia, abbiamo precedentemente dimostrato che l’OCT può essere facilmente rimosso dai campioni di biorepository umani attraverso cicli di lavaggi e centrifugazione senza alterare il loro contenuto di sfingolipidi. Abbiamo anche precedentemente stabilito che gli sfingolipidi nei tessuti umani crioconservati nell’OCT sono stabili fino a 16 anni. In questo rapporto, delineiamo i passaggi e il flusso di lavoro per analizzare gli sfingolipidi nei campioni di tessuto umano incorporati nell’OCT, inclusi il lavaggio dei tessuti, la pesatura dei tessuti per la normalizzazione dei dati, l’estrazione dei lipidi, la preparazione di campioni per l’analisi mediante cromatografia liquida elettrospray ionizzazione tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS / MS), integrazione dei dati di spettrometria di massa, normalizzazione dei dati e analisi dei dati.
Introduction
Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi noti per il loro ruolo nel metabolismo umano e nella malattia 1,2. Regolano processi cellulari complessi come la migrazione cellulare, la sopravvivenza e la morte cellulare, il movimento cellulare, il traffico vescicolare, l’invasione cellulare e le metastasi, l’angiogenesi e la produzione di citochine 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . I difetti nella regolazione del metabolismo degli sfingolipidi contribuiscono all’inizio e alla progressione dei tumori, determinano quanto siano aggressivi i tumori e come i tumori rispondano e sviluppino resistenza alla terapia 3,10. Pertanto, a causa di questi ampi impatti sull’eziologia della malattia, i metodi analitici che possono stabilire con precisione le alterazioni degli sfingolipidi specifici della malattia sono strumenti importanti. La spettrometria di massa (MS) è il metodo più accurato e affidabile per analizzare le alterazioni degli sfingolipidi.
I campioni umani che possono essere utilizzati per l’analisi delle alterazioni degli sfingolipidi possono essere ottenuti prospetticamente dalla suite chirurgica o retrospettivamente dai biodepositi tissutali. I tessuti freschi della chirurgia sono vantaggiosi perché possono essere analizzati direttamente dalla SM o da altri metodi analitici. Tuttavia, l’acquisizione prospettica di tessuti presenta ostacoli amministrativi, tecnici e logistici e la raccolta di campioni sufficienti per raggiungere il potere statistico può essere difficile. Ottenere tessuti da biorepository è vantaggioso perché possono essere acquisiti retrospettivamente, in gran numero, e i biorepository confermano istologia e patologia, utilizzano procedure operative standard per conservare e conservare criogenicamente i tessuti e possono fornire dati clinicopatologici che possono essere utilizzati per analisi di correlazione. Tuttavia, per preservare le caratteristiche molecolari e strutturali, i biorepository possono crioconservare i tessuti incorporandoli in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT), che abbiamo dimostrato interferisce con i saggi di normalizzazione dei dati e la quantificazione degli sfingolipidi mediante cromatografia liquida elettrospray ionizzazione tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS)11 . È stato inoltre dimostrato che l’alcol polivinilico e il glicole polietilenico, i componenti primari del composto OCT, determinano la soppressione ionica in altre piattaforme di analisi della SM12,13,14,15. Pertanto, il composto OCT deve essere rimosso dai tessuti prima dell’analisi sfingolipidomica mediante SM.
In un precedente rapporto, abbiamo convalidato un protocollo per la rimozione del composto OCT da campioni umani per l’analisi LC-ESI-MS/MS11 e la metodologia utilizzata per la pesatura dei tessuti per la normalizzazione dei dati11. Qui, descriviamo in dettaglio le fasi del protocollo di rimozione del composto OCT sfingolipidomico (sOCTrP) e mostriamo dati rappresentativi da tumori dell’adenocarcinoma polmonare umano e normali tessuti adiacenti non coinvolti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’OCT è un comune agente di crioconservazione a lungo termine utilizzato nei biorepository. Tuttavia, l’OCT può provocare la soppressione ionica quando i tessuti vengono analizzati da varie piattaforme di spettrometria di massa12,13,14,15, o provocare la perdita di segnale quando i campioni vengono analizzati da LC-ESI-MS/MS 11. L’OCT nei tessuti crioconservati può an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I servizi e il supporto del progetto di ricerca sono stati forniti dal VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core e dal VCU Lipidomics and Metabolomics Core, che sono supportati in parte con il finanziamento del NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. . Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
