Summary

Vorbereitung von menschlichem Gewebe, eingebettet in die optimale Schnitttemperaturmischung für die massenspektrometrische Analyse

Published: April 27, 2021
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Summary

Sphingolipide sind bioaktive Metaboliten mit einer gut etablierten Rolle bei menschlichen Erkrankungen. Die Charakterisierung von Veränderungen in Geweben mit Massenspektrometrie kann Rollen in der Krankheitsätiologie aufdecken oder therapeutische Ziele identifizieren. Die OCT-Verbindung, die für die Kryokonservierung in Biorepositorien verwendet wird, stört jedoch die Massenspektrometrie. Wir skizzieren Methoden zur Analyse von Sphingolipiden in menschlichen Geweben, die in OCT mit LC-ESI-MS/MS eingebettet sind.

Abstract

Sphingolipide sind zelluläre Komponenten, die eine gut etablierte Rolle im menschlichen Stoffwechsel und bei Krankheiten spielen. Die Massenspektrometrie kann verwendet werden, um festzustellen, ob Sphingolipide bei einer Krankheit verändert sind, und um zu untersuchen, ob Sphingolipide klinisch gezielt eingesetzt werden können. Richtig durchgeführte prospektive Studien, die Gewebe direkt aus dem OP-Bereich gewinnen, können jedoch zeitaufwendig und technisch, logistisch und administrativ herausfordernd sein. Im Gegensatz dazu können retrospektive Studien die Vorteile kryokonservierter menschlicher Proben nutzen, die bereits in großer Anzahl in Gewebebiorepositorien verfügbar sind. Weitere Vorteile der Beschaffung von Geweben aus Biorepositorien sind der Zugang zu Informationen, die mit den Gewebeproben verbunden sind, einschließlich Histologie, Pathologie und in einigen Fällen klinisch-pathologischen Variablen, die alle verwendet werden können, um Korrelationen mit Lipidomics-Daten zu untersuchen. Technische Einschränkungen im Zusammenhang mit der Inkompatibilität der optimalen Schnitttemperaturverbindung (OCT), die in der Kryokonservierung und Massenspektrometrie verwendet wird, stellen jedoch eine technische Barriere für die Analyse von Lipiden dar. Wir haben jedoch bereits gezeigt, dass OCT leicht aus menschlichen Biorepository-Proben durch Wasch- und Zentrifugationszyklen entfernt werden kann, ohne ihren Sphingolipidgehalt zu verändern. Wir haben auch zuvor festgestellt, dass Sphingolipide in menschlichen Geweben, die in OCT kryokonserviert werden, bis zu 16 Jahre stabil sind. In diesem Bericht beschreiben wir die Schritte und den Workflow zur Analyse von Sphingolipiden in menschlichen Gewebeproben, die in OCT eingebettet sind, einschließlich Waschtücher, Wiegen von Geweben zur Datennormalisierung, Extraktion von Lipiden, Vorbereitung von Proben für die Analyse durch Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS / MS), Massenspektrometrie-Datenintegration, Datennormalisierung und Datenanalyse.

Introduction

Sphingolipide sind bioaktive Metaboliten, die für ihre Rolle im menschlichen Stoffwechsel und bei Krankheiten bekanntsind 1,2. Sie regulieren komplexe zelluläre Prozesse wie Zellmigration, Zellüberleben und -tod, Zellbewegung, vesikulären Transport, Zellinvasion und Metastasierung, Angiogenese und die Produktion von Zytokinen 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekte in der Regulation des Sphingolipidstoffwechsels tragen zur Entstehung und Progression von Krebserkrankungen bei, bestimmen, wie aggressiv Krebserkrankungen sind und wie Krebserkrankungen auf die Therapie ansprechen und Resistenzen gegen diese entwickeln 3,10. Aufgrund dieser breiten Auswirkungen auf die Ätiologie von Krankheiten sind daher analytische Methoden, die krankheitsspezifische Sphingolipidveränderungen präzise feststellen können, wichtige Werkzeuge. Die Massenspektrometrie (MS) ist die genaueste und zuverlässigste Methode zur Analyse von Sphingolipidveränderungen.

Humanproben, die für die Analyse von Sphingolipidveränderungen verwendet werden können, können prospektiv aus dem OP-Bereich oder retrospektiv aus Gewebe-Biorepositorien gewonnen werden. Frischgewebe aus der Chirurgie sind vorteilhaft, da sie direkt mittels MS oder anderen Analysemethoden analysiert werden können. Der prospektive Erwerb von Geweben birgt jedoch administrative, technische und logistische Hürden, und das Sammeln ausreichender Proben, um statistische Aussagekraft zu erreichen, kann eine Herausforderung sein. Die Gewinnung von Geweben aus Biorepositorien ist vorteilhaft, da sie retrospektiv in großer Zahl erworben werden können und Biorepositorien Histologie und Pathologie bestätigen, Standardarbeitsanweisungen verwenden, um Gewebe kryogen zu konservieren und zu lagern, und klinisch-pathologische Daten liefern können, die für Korrelationsanalysen verwendet werden können. Um jedoch molekulare und strukturelle Merkmale zu erhalten, können Biorepositorien Gewebe kryokonservieren, indem sie sie in eine optimale Schnitttemperatur (OCT) -Verbindung einbetten, was nachweislich die Datennormalisierungsassays und die Quantifizierung von Sphingolipiden durch Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) stört11 . Es wurde auch gezeigt, dass Polyvinylalkohol und Polyethylenglykol, die Hauptkomponenten in OCT-Verbindungen, zu einer Ionenunterdrückung in anderen MS-Analyseplattformenführen 12,13,14,15. Daher muss die OCT-Verbindung vor der sphingolipidomischen Analyse durch MS aus dem Gewebe entfernt werden.

In einem früheren Bericht haben wir ein Protokoll für die Entfernung von OCT-Verbindungen aus menschlichen Proben für die LC-ESI-MS/MS-Analyse 11 und die Methodik zum Wiegen von Geweben zur Datennormalisierung11 validiert. Hier beschreiben wir die Schritte des sphingolipidomischen OCT-Compound-Removal Protocol (sOCTrP) und zeigen repräsentative Daten von menschlichen Lungenadenokarzinomtumoren und normalen benachbarten unbeteiligten Geweben.

Protocol

De-identifiziertes menschliches Lungengewebe wurde vom Tissue and Data Acquisition and Analysis Core der Virginia Commonwealth University (VCU) im Rahmen eines vom internen Prüfungsausschuss (IRB) genehmigten Protokolls (#HM2471) gewonnen. Die Verwendung von Mäusen für die Forschung und Ernte von Mäusegeweben wurde vom VCU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. 1. Vorbereitung der Materialien HINWEIS: Diese Schritte sollten einen Tag vor de…

Representative Results

In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert eine Methode zur Entfernung von OCT aus kryokonservierten menschlichen Geweben und wiegen die Gewebe für die Analyse durch LC-ESI-MS/MS. Die für dieses Verfahren erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. In Abbildung 1 sind die Ergebnisse eines typischen Experiments dargestellt, bei dem 10 menschliche Lungenadenokarzinom-Tumoren und 10 normale benachbarte Gewebe gewaschen wurden, um OCT zu entfernen und mit LC-ESI-MS / MS analysi…

Discussion

OCT ist ein gängiges Langzeit-Kryokonservierungsmittel, das in Biorepositorien verwendet wird. OCT kann jedoch zu einer Ionenunterdrückung führen, wenn Gewebe mit verschiedenen Massenspektrometrieplattformen12,13,14,15 analysiert werden, oder zu Signalverlust, wenn Proben mit LC-ESI-MS/MS 11 analysiert werden. OCT in kryokonservierten Geweben kann auch Gewebenormalisi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dienstleistungen und Unterstützung des Forschungsprojekts wurden vom VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core und dem VCU Lipidomics and Metabolomics Core bereitgestellt, die teilweise mit Mitteln des NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059 unterstützt werden. Diese Arbeit wurde von National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima) unterstützt.

Materials

1 mL polypropylene pipette tips NA NA Used to retrieve specimens
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes NA NA
10 mL Erlenmeyer flask VWR 89091-116 Used for tube and tissue weighing
AB Sciex Analyst 1.6.2 Sciex NA Software to analyze and integrate MS data
Ammonium formate Fisher Scientific A11550 For LC mobile phases
Analytical scale NA NA Scale that is accurate to 0.1 mg
Bottle top dispenser Sartorius LH-723071 Used for dispensing solvents
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine Avanti Polar Lipids LM2212 Internal standard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine Avanti Polar Lipids LM2511 Internal standard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene Avanti Polar Lipids LM2512 Internal standard
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine Avanti Polar Lipids LM2312 Internal standard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L VWR EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids Thermo Scientific 75007309 To prevent biohazard aeresols during centrifugation
Conflikt Decon Labs 4101 Decontaminant
CTO-20A/20AC Column Oven Shimadzu NA For LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol Avanti Polar Lipids LM2000 Internal standard
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate Avanti Polar Lipids LM2144 Internal standard
DGU20A5R degasser Shimadzu NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm VWR 53283-800 13×100 mm screw top tubes
Heated water bath NA NA For overnight lipid extraction
Homogenizer 150 Fisher Scientific 15-340-167 triturate tissues
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe Fisher Scientific 15-340-177 for homogenization
Kimwipes Kimtech 34120 Laboratory grade tissue used to make wicks
Methanol LC-MS Grade 4L VWR EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binary pump system Shimadzu NA For LC-MS
Permanent marker VWR 52877-310
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) VWR 89001-502 13×100 mm screw top tube caps
Phosphate bufffered saline Thermo Scientific 10010023 To retrieve specimens from tubes after washing
Repeater pipette Eppendorf 4987000118 To dispense LC-MS internal standards
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone VWR 89239-020 Autoinjector vial caps
Screw Thread Glass Vials with ID Patch VWR 46610-724 Autoinjector vials
SIL-30AC autoinjector Shimadzu NA
SpeedVac Thermo Scientific SPD2030P1220 For drying solvents
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column Sigma Aldrich 53822-U For LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System Sciex NA For LC-ESI-MS/MS
Ultrasonic water bath Branson Model 2800 for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids
Vortexer NA NA For sOCTrP and resuspending dried lipids
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass VWR 47729572 13×100 glass culture tubes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS VWR BDH83645.400

References

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Cite This Article
Boyd, A. E., Allegood, J., Lima, S. Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (170), e62552, doi:10.3791/62552 (2021).

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