質量分析のための最適な切削温度化合物に包埋されたヒト組織の調製
Summary
スフィンゴ脂質は、ヒトの疾患において十分に確立された役割を有する生理活性代謝物である。質量分析で組織の変化を特徴づけることで、疾患の病因における役割を明らかにしたり、治療標的を特定したりすることができます。しかし、バイオリポジトリでの凍結保存に使用されるOCT化合物は、質量分析を妨害します。OCTに包埋したヒト組織中のスフィンゴ脂質をLC-ESI-MS/MSで解析する方法を概説する。
Abstract
スフィンゴ脂質は、ヒトの代謝および疾患において十分に確立された役割を有する細胞成分である。質量分析は、スフィンゴ脂質が疾患において変化しているかどうかを決定し、スフィンゴ脂質が臨床的に標的化できるかどうかを調べるために使用することができる。ただし、手術室から直接組織を取得する適切な検出力の前向き研究は、時間がかかり、技術的、ロジスティック的、および管理的に困難な場合があります。対照的に、後ろ向き研究は、組織バイオリポジトリですでに入手可能な、通常は大量に凍結保存されたヒト検体を利用することができます。バイオレポジトリーから組織を調達する他の利点には、組織学、病理学、および場合によっては臨床病理学的変数を含む組織標本に関連する情報へのアクセスが含まれ、これらはすべてリピドミクスデータとの相関を調べるために使用することができる。しかしながら、凍結保存および質量分析に使用される最適切断温度化合物(OCT)の非適合性に関連する技術的限界は、脂質の分析のための技術的障壁である。しかし、OCTは、スフィンゴ脂質含有量を変えることなく、洗浄と遠心分離のサイクルを通じて、ヒトバイオリポジトリ標本から簡単に除去できることを以前に示しました。また、OCTで凍結保存されたヒト組織中のスフィンゴ脂質は、最大16年間安定していることを以前に確立しました。本報告では、OCTに埋め込まれたヒト組織検体中のスフィンゴ脂質分析の手順とワークフローについて、組織の洗浄、データ正規化のための組織の計量、脂質の抽出、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS)による分析用サンプルの調製、質量分析データ統合、データ正規化、データ解析などについて概説する。
Introduction
スフィンゴ脂質は、ヒトの代謝および疾患における役割で知られている生理活性代謝物です1,2。それらは、細胞移動、細胞の生存と死、細胞の動き、小胞輸送、細胞の浸潤と転移、血管新生、サイトカインの産生などの複雑な細胞プロセスを調節します1,2,3,4,5,6,7,8,9 .スフィンゴ脂質代謝の調節における欠陥は、癌の開始および進行に寄与し、癌がどれほど攻撃的であるか、および癌がどのように反応し、治療に対する耐性を発達させるかを決定する3,10。したがって、疾患の病因に対するこれらの広範な影響のために、疾患特異的スフィンゴ脂質の変化を正確に確立できる分析方法は重要なツールです。質量分析(MS)は、スフィンゴ脂質の変化を分析するための最も正確で信頼性の高い方法です。
スフィンゴ脂質の変化の分析に使用できるヒト検体は、手術室から前向きに、または組織バイオリポジトリから遡及的に取得できます。手術からの新鮮な組織は、MSまたは他の分析方法によって直接分析することができるので有利である。ただし、組織を前向きに取得するには、管理上、技術上、およびロジスティック上のハードルがあり、統計的検出力に到達するのに十分な標本を収集することは困難な場合があります。バイオレポジトリーから組織を取得することは、遡及的に大量に取得でき、バイオリポジトリは組織学と病理を確認し、標準的な操作手順を使用して組織を極低温で保存し、相関分析に使用できる臨床病理学的データを提供できるため、有利です。しかし、分子的および構造的特徴を維持するために、バイオリポジトリは組織を最適切断温度(OCT)化合物に埋め込むことによって凍結保存することができ、これはデータ正規化アッセイおよび液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS)によるスフィンゴ脂質の定量を妨げることを示しました11。.また、OCT化合物の主成分であるポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールが、他のMS分析プラットフォームにおいてイオン抑制をもたらすことも示されている12、13、14、15。したがって、OCT化合物は、MSによるスフィンゴリピドミック分析の前に組織から除去する必要があります。
以前のレポートでは、LC-ESI-MS/MS分析のためのヒト検体からのOCT化合物の除去プロトコル11 と、データ正規化のための組織の計量に使用される方法論11を検証しました。ここでは、スフィンゴリピドミックOCT化合物除去プロトコル(sOCTrP)の手順を詳述し、ヒト肺腺癌腫瘍および正常な隣接非関与組織からの代表的なデータを示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
OCTは、バイオリポジトリで使用される一般的な長期凍結保存剤です。しかしながら、OCTは、組織が様々な質量分析プラットフォーム12、13、14、15によって分析されるときにイオン抑制をもたらし、またはサンプルがLC-ESI-MS/MS 11によって分析されるときにシグナルの損失をもたら?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究プロジェクトのサービスとサポートは、VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis CoreとVCU Lipidomics and Metabolomics Coreによって提供され、NIH-NCIがんセンター支援助成金P30CA016059からの資金提供を受けて部分的に支援されています。この研究は、国立衛生研究所助成金R21CA232234(サンティアゴリマ)の支援を受けました。
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
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