Beredning av mänskliga vävnader inbäddade i optimal skärtemperaturförening för masspektrometrianalys
Summary
Sfingolipider är bioaktiva metaboliter med väletablerade roller i mänsklig sjukdom. Karakteristiska förändringar i vävnader med masspektrometri kan avslöja roller i sjukdomsetiologi eller identifiera terapeutiska mål. OCT-föreningen som används för kryokonservering i biorepositorier stör emellertid masspektrometri. Vi beskriver metoder för att analysera sfingolipider i mänskliga vävnader inbäddade i OCT med LC-ESI-MS / MS.
Abstract
Sfingolipider är cellulära komponenter som har väletablerade roller i mänsklig metabolism och sjukdom. Masspektrometri kan användas för att avgöra om sfingolipider förändras i en sjukdom och undersöka om sfingolipider kan riktas kliniskt. Korrekt drivna prospektiva studier som förvärvar vävnader direkt från operationssviten kan dock vara tidskrävande och tekniskt, logistiskt och administrativt utmanande. Däremot kan retrospektiva studier dra nytta av kryokonserverade mänskliga prover som redan finns tillgängliga, vanligtvis i stort antal, vid vävnadsbiorepositorier. Andra fördelar med att skaffa vävnader från biorepositorier inkluderar tillgång till information associerad med vävnadsproverna inklusive histologi, patologi och i vissa fall kliniskpatologiska variabler, som alla kan användas för att undersöka korrelationer med lipidomikdata. Tekniska begränsningar relaterade till inkompatibiliteten hos optimal skärtemperaturförening (OCT) som används i kryokonservering och masspektrometri är emellertid en teknisk barriär för analys av lipider. Vi har dock tidigare visat att OCT lätt kan avlägsnas från humana biorepositorprover genom cykler av tvättar och centrifugering utan att ändra deras sfingolipidinnehåll. Vi har också tidigare konstaterat att sfingolipider i mänskliga vävnader kryokonserverade i OCT är stabila i upp till 16 år. I den här rapporten beskriver vi stegen och arbetsflödet för att analysera sfingolipider i humana vävnadsprover som är inbäddade i OCT, inklusive tvättvävnader, vägning av vävnader för datanormalisering, extraktion av lipider, beredning av prover för analys med vätskekromatografi elektrosprayjonisering tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS / MS), masspektrometridataintegration, datanormalisering och dataanalys.
Introduction
Sfingolipider är bioaktiva metaboliter kända för sina roller i mänsklig metabolism och sjukdom 1,2. De reglerar komplexa cellulära processer såsom cellmigration, cellöverlevnad och död, cellrörelse, vesikulär handel, cellulär invasion och metastasering, angiogenes och produktion av cytokiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekter i regleringen av sfingolipidmetabolism bidrar till initiering och progression av cancer, bestämmer hur aggressiva cancerformer är och hur cancer svarar på och utvecklar resistens mot terapi 3,10. På grund av dessa breda effekter på sjukdomens etiologi är därför analysmetoder som exakt kan fastställa sjukdomsspecifika sfingolipidförändringar viktiga verktyg. Masspektrometri (MS) är den mest exakta och pålitliga metoden för att analysera sfingolipidförändringar.
Mänskliga prover som kan användas för analys av sfingolipidförändringar kan erhållas prospektivt från operationssviten eller retrospektivt från vävnadsbiorepositorier. Färska vävnader från kirurgi är fördelaktiga eftersom de kan analyseras direkt med MS eller andra analysmetoder. Att förvärva vävnader framåtriktat har dock administrativa, tekniska och logistiska hinder, och att samla in tillräckligt med prover för att nå statistisk kraft kan vara utmanande. Att erhålla vävnader från biorepositorier är fördelaktigt eftersom de kan förvärvas retrospektivt, i stort antal, och biorepositorier bekräftar histologi och patologi, använder standardrutiner för att kryogent bevara och lagra vävnader och kan tillhandahålla kliniskpatologiska data som kan användas för korrelationsanalyser. För att bevara molekylära och strukturella egenskaper kan biorepositorier dock kryokonservera vävnader genom att bädda in dem i optimal skärtemperatur (OCT) -förening, vilket vi har visat stör datanormaliseringsanalyser och kvantifieringen av sfingolipider genom vätskekromatografi elektrosprayjonisering tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS / MS)11 . Det har också visats att polyvinylalkohol och polyetylenglykol, de primära komponenterna i OCT-förening, resulterar i jonundertryckning i andra MS-analysplattformar12,13,14,15. Därför måste ULT-föreningen avlägsnas från vävnader före sfingolipidomisk analys av MS.
I en tidigare rapport har vi validerat ett protokoll för avlägsnande av ULT-förening från humana prover för LC-ESI-MS/MS-analys 11 och den metod som används för att väga vävnader för datanormalisering11. Här beskriver vi stegen i sfingolipidomic OCT compound-removal protocol (sOCTrP) och visar representativa data från humana lungadenokarcinomtumörer och normala intilliggande oengagerade vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT är ett vanligt långsiktigt kryokonserveringsmedel som används i biorepositorier. OCT kan dock resultera i jonundertryckning när vävnader analyseras av olika masspektrometriplattformar12,13,14,15, eller resultera i signalförlust när prover analyseras av LC-ESI-MS/MS 11. OCT i kryokonserverade vävnader kan också störa vävnadsnormaliseringsmetoder som vägnin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tjänster och stöd för forskningsprojektet tillhandahölls av VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core och VCU Lipidomics and Metabolomics Core, som delvis stöds med finansiering från NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
References
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. . Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
