Kirurgi og prøvebehandling for korrelerativ billeddannelse af Murine lungeventilen
Summary
Her beskriver vi en korrelativ arbejdsgang for excision, tryk, fiksering og billeddannelse af murinepulmonalventilen for at bestemme bruttokonformationen og lokale ekstracellulære matrixstrukturer.
Abstract
De underliggende årsager til hjerteklap relateret sygdom (HVD) er undvigende. Murine dyremodeller giver et glimrende værktøj til at studere HVD, men den kirurgiske og instrumentale ekspertise, der kræves for præcist at kvantificere strukturen og organisationen på tværs af flere længdeskalaer, har hæmmet dens fremskridt. Dette arbejde giver en detaljeret beskrivelse af murine dissektion, en bloc farvning, prøve behandling, og korrelative billeddannelse procedurer for skildring af hjerteklap på forskellige længde skalaer. Hydrostatisk transvalvulartryk blev brugt til at kontrollere den tidsmæssige heterogenitet ved kemisk fastsættelse af hjerteklap kropsbygning. Mikrocomputertomografi (μCT) blev brugt til at bekræfte hjerteklapperens geometri og give en reference til den downstream-prøvebehandling, der er nødvendig for den serielle blok ansigtsscanningselektronmikroskopi (SBF-SEM). Seriel SEM-billeder i høj opløsning af den ekstracellulære matrix (ECM) blev taget og rekonstrueret for at give en lokal 3D-repræsentation af organisationen. μCT- og SBF-SEM-billeddannelsesmetoder blev derefter korreleret for at overvinde den rumlige variation på tværs af lungeventilen. Selv om det præsenterede arbejde udelukkende er på lungeventilen, kan denne metode anvendes til at beskrive den hierarkiske organisation i biologiske systemer og er afgørende for den strukturelle karakterisering på tværs af flere længdeskalaer.
Introduction
Lungeventilen (PV) tjener til at sikre ensrettet blodgennemstrømning mellem højre hjertekammer og lungepulsåren. Lungeventil misdannelser er forbundet med flere former for medfødt hjertesygdom. Den nuværende behandling for medfødt hjerteklap sygdom (HVD) er valvular reparation eller ventil udskiftning, som kan nødvendiggøre flere invasive operationer i hele en patients levetid1. Det er almindeligt accepteret, at hjerteklapperens funktion er afledt af dens struktur, ofte omtalt som strukturfunktionen korrelerer. Mere specifikt dikterer hjertets geometriske og biomekaniske egenskaber dets funktion. De mekaniske egenskaber bestemmes igen af ECM’s sammensætning og organisation. Ved at udvikle en metode til bestemmelse af murine hjerteklappers biomekaniske egenskaber kan transgene dyremodeller bruges til at afhøre ECM’s rolle på hjerteklapfunktion og dysfunktion2,3,4,5.
Den murindyrsmodel har længe været betragtet som standarden for molekylære undersøgelser, fordi transgene modeller er lettere tilgængelige hos mus sammenlignet med andre arter. Murine transgene modeller giver en alsidig platform til forskning i hjerteklap-relaterede sygdomme6. Men den kirurgiske ekspertise og instrumentering krav til at karakterisere både geometri og ECM organisation har været en stor forhindring i udviklingen af HVD forskning. Hstological data i litteraturen giver et billede i murine hjerteklap ekstracellulær matrix indhold, men kun i form af 2D-billeder, og er ude af stand til at beskrive sin 3D arkitektur7,8. Derudover er hjerteklapen både rumligt og tidsmæssigt heterogen, hvilket gør det vanskeligt at drage konklusioner på tværs af eksperimenter vedrørende ECM-organisation, hvis prøveudtagningen og kropsbygningen ikke er fast. Konventionelle 3D-karakteriseringsmetoder,f.eks.
Dette arbejde beskriver en fuldt korrelativ arbejdsgang, hvor den tidsmæssige heterogenitet på grund af hjertecyklussen blev behandlet ved at fastgøre kropsbygning af murine PV med hydrostatisk transvalvular tryk. Den rumlige heterogenitet blev kontrolleret præcist af stikprøver af interesseområder og registrering af datasæt fra forskellige billeddannelsesmetoder, navnlig μCT og seriel blokscanning af elektronmikroskopier på tværs af forskellige længdeskalaer. Denne metode til scouting med μCT til styring af downstream-prøveudtagning er tidligere blevet foreslået, men fordi lungeventilen udviser tidsvariation, var der behov for et ekstra kontrolniveau på det kirurgiske niveau11.
In vivo-undersøgelser, der beskriver murin hjerteklapbiomekanik, er sparsomme og er i stedet afhængige af beregningsmodeller, når de beskriver deformationsadfærden. Det er af afgørende betydning, at lokale ekstracellulære data på nanometerlængdeskalaen relateres til hjerteklapperens geometri og placering. Dette giver igen kvantificerbare, rumligt kortlagte fordelinger af mekanisk bidragende ECM-proteiner, som kan bruges til at styrke eksisterende biomekaniske hjerteklapmodeller12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fjernelse af hjertekamrene tjener to formål. For det første udsætte ventrikelsiden for det atmosfæriske tryk og derved kun behøver at anvende et transvalvulartryk frapulsventilens arterielle side for at lukke, og for det andet at give en stabil base for at forhindre vridning af lungestammen. Under tryk spredes lungestammen radialt og ringere, hvilket gør den tilbøjelig til at vride, hvilket forårsager lungestammens sammenbrud. Forbelastning af lungeventilen med en saltvandsopløsning giver et ekstra kvalitetskont…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde støttes delvist af R01HL139796 og R01HL128847 tilskud til CKB og RO1DE028297 og CBET1608058 til DWM.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
