ネズミ肺動脈弁の相関画像化のための手術とサンプル処理
Summary
ここでは、マウス肺動脈弁の切除、加圧、固定、画像化のための相関ワークフローを説明し、総立体構造および局所細胞外マトリックス構造を決定する。
Abstract
心臓弁関連疾患(HVD)の根本的な原因は、とらえどころがありません。マウス動物モデルはHVDを研究するための優れたツールを提供しますが、複数の長さのスケールにわたって構造と組織を正確に定量化するために必要な外科的および器械的専門知識は、その進歩を妨げている。この研究は、異なる長さのスケールで心臓弁を描写するためのマウス解剖、エンブロック染色、サンプル処理、および相関画像化手順の詳細な説明を提供する。静水圧経弁は、心臓弁の立体構造を化学的に固定することによって時間的不均一性を制御するために使用された。マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)を使用して、心臓弁の形状を確認し、シリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)に必要な下流サンプル処理の基準を提供しました。細胞外マトリックス(ECM)の高解像度シリアルSEM画像を撮影し、再構成して組織のローカル3D表現を提供した。μCTおよびSBF-SEMイメージング法を相関させ、肺動脈弁全体の空間変動を克服した。提示された作業は肺動脈弁に関するものですが、この方法論は、生物学的システムにおける階層的組織を記述するために採用することができ、複数の長さのスケールにわたる構造的特徴付けにとって極めて重要です。
Introduction
肺弁(PV)は、右心室と肺動脈との間の単方向血流を確保するのに役立つ。肺動脈弁奇形は、先天性心疾患のいくつかの形態に関連付けられている。先天性心弁疾患(HVD)の現在の治療法は弁膜修復または弁置換であり、患者の生涯を通じて複数の侵襲的手術を必要とすることができる1。心臓弁の機能はその構造に由来することが広く受け入れられており、構造機能相関と呼ばれることが多い。より具体的には、心臓の幾何学的および生体力学的特性がその機能を決定する。機械的特性は、ECMの構成および構成によって決定されます。マウス心臓弁の生体力学的特性を決定する方法を開発することにより、トランスジェニック動物モデルは、心臓弁機能および機能不全2、3、4、5におけるECMの役割を問い込むために使用することができる。
マウス動物モデルは、トランスジェニックモデルが他の種と比較してマウスでより容易に入手可能であるため、長い間分子研究の標準と見なされてきました。マウストランスジェニックモデルは、心臓弁関連疾患6を研究するための汎用性の高いプラットフォームを提供します。しかし、幾何学とECM組織の両方を特徴付けるための外科的専門知識と計測要件は、HVD研究を進める上で大きなハードルとなっています。文献中のHstologicalデータは、マウス心臓弁細胞外マトリックス含有量に画像を提供するが、2D画像の形でのみ、その3Dアーキテクチャ7、8を記述することができない。さらに、心臓弁は空間的にも時間的にも異種であり、サンプリングと立体構造が固定されていない場合、ECM組織に関する実験全体で結論を出すのは困難です。MRIや3D心エコー検査などの従来の3D特性解析法は、ECM成分9,10の解決に必要な解像度を提供していない。
この研究は、心周期による時間的不均一性が、マウスPVの立体構造を静水圧横切り圧力で固定することによって対処された完全に相関的なワークフローを詳述する。空間的な異質性は、対象領域をサンプリングし、異なるイメージングモダリティ、特にμCTおよびシリアルブロック顔走査電子顕微鏡のデータセットを異なる長さのスケールにわたって登録することによって正確に制御されました。下流サンプリングを導くμCTによるスカウトのこの方法は以前に提案されてきたが、肺弁は時間的変動を示すため、外科レベル11でさらなる制御が必要であった。
マウス心臓弁バイオメカニクスを記述するインビボ研究はまばらであり、代わりに変形挙動を記述する際に計算モデルに依存する。ナノメートルの長さのスケールの局所的な細胞外データが心臓弁の幾何学的形状および位置に関連していることは非常に重要である。これは、順番に、既存の生体機械心臓弁モデル12、13、14を補強するために使用することができる機械的に寄与するECMタンパク質の定量化可能な、空間的にマッピングされた分布を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
心室の除去は2つの目的を果たす。まず、心室側を大気圧に曝し、それにより肺弁の動脈側から経弁圧を閉じるだけで、第2に、肺幹のねじれを防止する安定した塩基を提供する。加圧中、肺幹は放射状に劣って膨張し、ねじれやすく、肺幹の崩壊を引き起こす。肺弁に生理液をプリロードすると、加圧が適切であり、システムに漏れがあるかどうかの確認が追加で確認できます。一次固定剤?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、部分的には、R01HL139796およびR01HL128847がCKBおよびRO1DE028297およびCBET1608058に対してDWMに対して付与することによってサポートされています。
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
