Summary
כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מתאם עבור כריתה, לחץ, קיבעון, והדמיה של שסתום הריאות מורין כדי לקבוע את הקונפורמציה ברוטו ומבני מטריצה חוץ תאיים מקומיים.
Abstract
הגורמים הבסיסיים למחלות הקשורות לשסתום הלב (HVD) הם חמקמקים. מודלים של בעלי חיים מורינים מספקים כלי מצוין לחקר HVD, עם זאת, המומחיות הכירורגית והאינסמנטלית הנדרשת לכימות מדויק של המבנה והארגון על פני קשקשים באורך רב עיכבו את התקדמותו. עבודה זו מספקת תיאור מפורט של ניתוח מורין, כתמי גוש, עיבוד מדגם, והליכי הדמיה מתאם לתיאור שסתום הלב בקשקשים באורך שונה. לחץ טרנס-וואולי הידרוסטטי שימש לשליטה בהטרוגניות הטמפורלית על ידי תיקון כימי של קונפורמציה שסתום הלב. טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT) שימשה לאישור הגיאומטריה של שסתום הלב ולספק התייחסות לעיבוד מדגם במורד הזרם הדרוש למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת פנים של בלוק טורי (SBF-SEM). תמונות SEM טוריות ברזולוציה גבוהה של המטריצה החוץ-תאית (ECM) צולמו ושוחזרו כדי לספק ייצוג תלת-ממדי מקומי של הארגון שלה. שיטות הדמיה μCT ו- SBF-SEM היו אז בקורלציה כדי להתגבר על השונות המרחבית על פני שסתום הריאות. למרות העבודה המוצגת היא אך ורק על שסתום הריאות, מתודולוגיה זו יכולה להיות מאומצת לתיאור הארגון ההיררכי במערכות ביולוגיות והיא מרכזית עבור האפיון המבני על פני קשקשים באורך מרובה.
Introduction
שסתום הריאות (PV) משמש כדי להבטיח זרימת דם חד כיוונית בין החדר הימני לעורק הריאות. מומים שסתום ריאות קשורים עם מספר צורות של מחלת לב מולדת. הטיפול הנוכחי למחלת שסתום לב מולדת (HVD) הוא תיקון valvular או החלפת שסתום, אשר יכול לדרוש ניתוחים פולשניים מרובים לאורך חייו של המטופל1. זה כבר מקובל כי הפונקציה של שסתום הלב נגזר מהמבנה שלה, המכונה לעתים קרובות את המבנה-פונקציה בקורלציה. ליתר דיוק, המאפיינים הגיאומטריים והביומכניים של הלב מכתיבים את תפקידו. המאפיינים המכניים, בתורם, נקבעים על ידי הרכב וארגון של ECM. על ידי פיתוח שיטה לקביעת המאפיינים הביומכניים של שסתומי לב מורינה, מודלים בעלי חיים מהונדסים יכולים לשמש כדי לחקור את התפקיד של ECM על תפקוד שסתום הלב תפקוד לקוי2,3,4,5.
מודל בעלי החיים המוריני נחשב זה מכבר לסטנדרט למחקרים מולקולריים מכיוון שמודלים מהונדסים זמינים יותר בעכברים בהשוואה למינים אחרים. מודלים מהונדסים מורין לספק פלטפורמה רב-תכליתית לחקר מחלות הקשורות שסתום לב6. עם זאת, המומחיות הכירורגית ודרישות המכשור לאפיון הן הגיאומטריה והן ארגון ECM היוו משוכה משמעותית בהתקדמות מחקר HVD. נתונים Hstological בספרות מספק תמונה לתוך תוכן מטריצה חוץ תאית שסתום לב מורין, אבל רק בצורה של תמונות 2D, ואינם מסוגלים לתאר את הארכיטקטורה 3D שלה7,8. בנוסף, שסתום הלב הוא הן מרחבי והן זמני הטרוגניים, מה שמקשה להסיק מסקנות על פני ניסויים לגבי ארגון ECM אם הדגימה וההתאמה אינם קבועים. שיטות אפיון תלת-ממדיות קונבנציונליות, כגון MRI או אקו-קרדיוגרפיה תלת-ממדית, אינן מספקות את הפתרון הדרוש לפתרון רכיבי ECM9,10.
עבודה זו מפרטת זרימת עבודה מתאם לחלוטין שבו הטרוגניות הטמפורלית עקב מחזור הלב טופלה על ידי תיקון הקונפורמציה של PV מורין עם לחץ טרנסוולבולרי הידרוסטטי. ההטרוגניות המרחבית נשלטה דווקא על ידי דגימת אזורי עניין ורישום ערכות נתונים מאופני הדמיה שונים, במיוחד μCT ומיקרוסקופיית פנים בלוק סדרתית סורקת מיקרוסקופיית אלקטרונים, על פני סולמות אורך שונים. שיטה זו של סקאוטינג עם μCT להנחיית דגימה במורד הזרם הוצעה בעבר, אך מכיוון ששסתום הריאות מציג וריאציה זמנית, היה צורך ברמת שליטה נוספת ברמה הניתוחית11.
במחקרים המתארים ביומכניקה של שסתום לב מוריני הם דלילים, ובמקום זאת, מסתמכים על מודלים חישוביים כאשר הם מתארים את התנהגות העיוות. זה בעל חשיבות קריטית כי נתונים חוץ תאיים מקומיים על סולם אורך ננומטר להיות קשורים הגיאומטריה ואת המיקום של שסתום הלב. זה, בתורו, מספק לכימות, מופה מרחבי הפצות של חלבוני ECM תורמים מכנית, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחזק את המודלים הקיימים שסתום הלב הביומכני12,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש בבעלי חיים במחקר זה היה בהתאם לוועדת הטיפול בבעלי חיים של בית החולים לילדים בפריסה ארצית תחת פרוטוקול AR13-00030.
1. כריתת שסתום ריאות
- תבודד אוטומטית את הכלים הדרושים עבור ניתוח העכבר. זה כולל מספריים עדינים, מלקחיים זעירים, מלחציים מיקרו וסקולריים, מלקחיים החלת מלחציים, מחזיקי מיקרונידל, מספריים קפיציים ומפסקים.
- התאקלם כל העכברים במשך מינימום של 2 שבועות לפני הניתוח. הסר C57BL/6 עכברים, בערך 1 שנה של גיל, מן הכלובים שלהם לשקול, ולאחר מכן להרדים עם קוקטייל קטמין / קסילאצין (3:1 קטמין:xylazine, 0.01 מ"ל לג גרם) מנת יתר.
- הנח את העכבר בתנוחת קליטת גדוש על מגש ואבטח את גפיו בקלטת. לאחר המאובטח, לבצע את בית החזה.
- לחשוף את הלב על ידי הסרת כל רקמת שומן עודף fascia.
- הסר את האטריום הימני ולפרף דרך החדר השמאלי עם תמיסת מלח בטמפרטורת החדר (0.9% NaCl). זלוף צריך לקחת כ 20 מ"ל מעל 30 s. התוצאה היא חימת העכבר.
- הסר את הלב כולו על ידי ניתוק הוועד הנבי מעולה, וונה קווה נחותה, עורק ריאות, ואבי העורקים. יש לנקוט בזהירות מיוחדת לעורק הריאות. חותכים כ 2 מ"מ מעל צומת פיתום עורקים, כמו זה ישמש צינור ללחץ.
- הסר את החדרים השמאליים והימנים כדי לחשוף תאים ללחץ אטמוספרי. ודא כי המבנה של גזע הריאות צריך להיות מושפע על ידי הסרת החדרים.
2. קיבוע לחץ של שסתום ריאות
- צינורות לחץ Anastomose עם עורק ריאות, משאירים מרחק של כ 1 מ"מ בין הצומת הסיני-צינורי לבין סוף הצינורות כדי להכיל תנועות גדולות של העלונים וגזע הריאות.
- העלו את המאגר ללחץ פיזיולוגי אנלוגי ומלאו אותו בתמיסת המלח. בדוק את מערכת הזרימה כדי לוודא שאין חסימות או בועות אוויר.
- חבר פקק שסתום ריאות anastomosed ולהבטיח זרימה נאותה דרך הצינורות (כלומר, אין בועות אוויר) על ידי החלפת דרכי היציאה. ברגע הזרימה מספקת, להעביר את התזרים שסתום ריאת anastomosed ולהבטיח לחץ של תא המטען ריאתי. זה מזוהה על ידי התנפצות תא המטען ריאתי.
- לאחר לחץ של גזע הריאות מאושר, לשלב בהדרגה פתרון קבוע ראשוני (1.25% גלוטרלדהיד, 1.0% paraformaldehyde ב 0.15 M cacodylate) עד תמיסת מלח מטוהר. זה נעשה על ידי הסרת חלק, כ -25% מקיבולת המאגר, של תמיסת מלח והחלפתו עם הקיבעון העיקרי.
זהירות: יש לענוד את הקיבורים המשמשים (paraformaldehyde ו- glutaraldehyde) רעילים מאוד וציוד מגן אישי מתאים (PPE) כדי להבטיח את הבטיחות. - מניחים גזה ספוגה הקיבעון על דגימת הרקמה כדי למנוע ייבוש.
- לנטרל את הקיבעון עבור 3 שעות, מילוי המאגר לפי הצורך כדי לשמור על לחץ מתמיד. לאורך כל הקיבעון, זה לא נדיר עבור שסתום הריאות להתכווץ בגלל הקיבעון הכימי. אם זה המקרה, כל הזמן לחדש את המאגר עם קיבעון ראשוני כדי לשמור על לחץ פיזיולוגי.
- לאחסן את שסתום הלב בפתרון הקיבויע ב 4 °C (5 °F) עד השימוש. דגימות אוחסנו עד שבוע ללא כל הבדל ניכר.
3. כתמים והטבעה מדגם En גוש15,16
זהירות: ריאגנטים מכתימים המשמשים בסעיף זה (אשלגן ferrocyanide, אוסמיום tetroxide, thiocarbohydrazide, אספרטט עופרת, אורניל אצטט) הם רעילים מאוד ויש לטפל בהם בזהירות רבה. מומלץ להשתמש במכסה אדים ו- PPE מתאים.
- כתמים
- לשטוף את דגימת שסתום הלב הקבוע במשך 5 דקות עם חיץ קקודילט 0.15 M קר. חזור על הכביסה פעמיים נוספות.
- לגמרי להטביע את שסתום הלב בתמיסה של 1.5% אשלגן ferrocyanide, 0.15 M קקודילאט, 2 mM סידן כלוריד, ו 2% osmium tetroxide, על קרח במשך 1 שעה.
- בזמן המדגם הוא דגירה, להכין פתרון thiocarbohydrazide (TCH) על ידי המסת 0.1 גרם של TCH ב 10 מ"ל של ddH2O. מניחים את הפתרון בתנור 60 °C ל 1 שעה. התעצבנו בעדינות מעת לעת כדי להבטיח ש-TCH יתמוסס לחלוטין. סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר מיד לפני השימוש.
- לשטוף את הדגימות עם טמפרטורת החדר ddH2O על ידי הצבת אותם בצינור של ddH2O במשך 5 דקות מעט להתסיס אותו על ידי ניעור המיכל. חזור על תהליך זה שלוש פעמים.
- מניחים אותו בתמיסת TCH מסוננת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. בצע את שלב הכביסה שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) עם טמפרטורת החדר ddH2O כמתואר בשלב 3.1.4.
- לאחר סיום, מניחים את המדגם ב 2% osmium tetroxide במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף אותו שוב בסך הכל שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם טמפרטורת החדר ddH2O.
- לדגור את המדגם ב 1% אורניל אצטט לילה ב 4 °C (50 °F).
- במהלך תקופה זו, להפוך פתרון של 0.066 גרם של עופרת חנקתי ב 10 מ"ל של תמיסה ציר חומצה אספרטית. כוונן את ה- pH ל- 5.5 עם 1 N KOH. מניחים את התמיסה בתנור 60 מעלות צלזיוס כדי להמיס עופרת חנקתית.
- לאחר הדגירה הלילית, בצע את שלב הכביסה כמתואר בשלב 3.1.4. חזור שלוש פעמים. לאחר מכן, לדגור את רקמת שסתום הלב בתמיסת אספרטט עופרת בשלב 3.1.8 בתנור 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- התייבשות
- לשטוף את הרקמות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם ddH2O. חזור שלוש פעמים.
- הכינו פתרונות חדשים של 20%, 50%, 70%, 90% ו-100% אתנול ב-ddH2O.
- כדי לייבש את רקמת שסתום הלב. בצע טיפולים הבאים של 20%, 50%, 70%, ו 90% אתנול על קרח במשך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן בצע שני טיפולים הבאים של 100% אתנול על קרח במשך 5 דקות.
- מעבירים את הרקמה לאצטון קר כקרח למשך 10 דקות. לאחר מכן מניחים אצטון טרי בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
- הטבעה
- הפוך את תערובת שרף (ראה טבלה של חומרים) על פי מפרטי היצרן: 11.4 גרם של רכיב A, 10 גרם של רכיב B, 0.3 גרם של רכיב C, ו 0.05-0.1 גרם של רכיב D. בתחילה לערבב רכיבים A ו- B על ידי חימום כל אחד מהרכיבים ל 60 °C (70 °F) לפני הוספת רכיבים C ו- D. התערובת תהפוך לצבע ענבר עם הוספת רכיבים C ו- D. זה יהיה אחיד כאשר מעורבב כראוי.
- הפוך תערובות עם יחסי נפח של 25:75, 50:50, ו 75:25 שרף:אצטון. מערבבים היטב.
- מניחים רקמות בטיפולים הבאים של 25:75, 50:50, ו 75:25 שרף:תערובת אצטון במשך 2 שעות כל אחד בטמפרטורת החדר.
- מניחים רקמות ב-100% שרף למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
- למחרת, מניחים רקמות ב-100% שרף טרי למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- מעבירים את רקמות שסתום הלב לקפסולה משובצת, מחליפה שרף טרי של 100%, ומניחים בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לריפוי.
- בצע הדמיה מתאמת כפי שמוצג להלן.
4. הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת
- הר את בלוק דגימת השרף על מחזיק מדגם μCT עם דבק (דבק או סרט דו צדדי עובד טוב).
- מניחים את המחזיק בתא μCT ולתקן אותו על הבמה על ידי בורג הקולט כך שאין תנועה של המחזיק. תנועה לדוגמה במהלך הסריקה תקטין את איכות התמונה.
- פתח את ממשק המשתמש של μCT על-ידי לחיצה כפולה על הסמל. הוסף פרוייקט על-ידי בחירת הסימן + לצד פרוייקטים ומלא את השדות הדרושים.
- לאחר יצירתו, מצא את הפרוייקט שנוצר ובחר אותו על-ידי לחיצה עליו. פעולה זו תפתח עמודה שניה רכישות. בחר את + לצד רכישות ומלא את השדות הדרושים.
- סגור את דלתות התא ולחמש את המערכת על ידי לחיצה על כפתור החימוש בלוח הקדמי או μCT. חימום צילומי רנטגן מממשק המשתמש על ידי בחירת הכפתור המציין חימום.
הערה: המערכת תכבה באופן אוטומטי את צילומי הרנטגן לאחר הליך חימום מוצלח. הפעל צילומי רנטגן על-ידי בחירת הלחצן. - התאם את סיבוב הבמה כך שמרכז הסיבוב של המדגם לא סוטה ממרכז הצג (כלומר, המדגם נמצא בשדה הראייה עבור הסריקה כולה). עבור המערכת המשמשת לניסוי זה, הדבר כרוך בהתאמת שלב העניין (ROI) תחת הכרטיסיה הנפתחת כמפורט להלן.
- הגדר את התאמת שלב ההפרש על-ידי הגדרת זווית הסיבוב ל- 0° וסימון קצה המדגם. לאחר מכן המדגם מסובב ל- 180° וקצה המדגם מסומן שוב.
- התאם את מיקום ציר x שלב ROI כך שקצה המדגם יהיה בין שני הקצוות האלה. חזור על תהליך זה עבור זוויות סיבוב של 90° ו- 270° עבור מיקום ה- y.
- במקרה שבו סיבוב המדגם גורם לקצוות לצאת משדה הראייה, הקטן את ההגדלה של צרכי ה- μCT עד שקצוות המדגם גלויים בזוויות שנקבעו לעיל וניתן לבצע התאמת שלב ROI גסה.
- לאחר ההגדלה התחתונה, הזז את המדגם או את הגלאי כדי להגדיל את ההגדלה וניתן לכוונן את מיקומי ה- ROI.
הערה: ייתכן שיהיה צורך לחזור על תהליך זה כדי להבטיח יישור. יישור נכון גורם לדוגמה המציגה תנועה אופקית מועטה עד ללא תנועה דרך כל זוויות הסיבוב לדוגמה.
- התאם את ה- μCT לפרמטרים הרצויים לסריקה באמצעות תוכנת היצרן. פרמטרים אלה כוללים פוטנציאל צינור, זרם צינור, מרחק גלאי, מרחק מדגם, זמן חשיפה, מסלול, ואת מספר התחזיות (ראה טבלה S1 עבור הפרמטרים רכישת μCT המשמש במחקר זה).
הערה: פרמטרי כיול, כגון שדות שקופים וסריקות שדה כהה, צריכים להישמר במפרט היצרן אלא אם צוין אחרת. לדוגמה, אם דגימה גדולה מדי והמערכת אינה יכולה להזיז את הדגימה מתצוגת השדה, יש להסיר את המדגם כדי לבצע סריקות ברורות של כיול שדה. - לאחר הגדרת הפרמטרים, ניתן לראות קירוב של משך הסריקה על-ידי לחיצה על לחצן הערכת זמן. בחר בלחצן התחל כדי להתחיל בסריקה.
- לאחר השלמת הסריקה, ודא כי צילומי הרנטגן כבויים, לפתוח את הקולט, ולהסיר בזהירות את הדגימה מתא μCT.
5. עיבוד לדוגמה ומתאם תמונה
- בנייה מחדש של תחזיות μCT באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורי מסונן עם התוכנה המסופקת על ידי היצרן (ראה טבלת חומרים).
- בחר בכרטיסיה סיור בחלק העליון של המסך. בחר את הכרטיסיה פרוייקט ורכישה.
- בחר את השייך לתבנית סיור עם הקרנה אחורית מסוננת. לחץ על לחצן התחל סיור.
- זהה ופולח את שסתום הריאות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. זה דורש ידע מוקדם של האנטומיה של שסתום הריאות17. בלחצים עורקיים גבוהים, העלונים coapt וחוסמים את לומן של שסתום הריאות.
- זהה את כיוון הניקוד ביחס לכיוון הסריקה ולדגימה. כוון מחדש את המדגם כך שכיוון הניתוק מיושר עם הציר הרצוי.
- זהה אזורים מעניינים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. בניסוי זה נבחרו הבטן (האמצעית) של העלון והצומת העורקי-ואלבולרי.
- הסר את השרף העודף ודגם על ידי סכין גילוח או ליטש עבור חתיכות גדולות של חומר, או על ידי microtome עבור חתיכות עדינות יותר.
- פעם אחת במיקום של עניין, להשוות את הדגימה הפיזית עם פרוסות μCT וירטואלי כדי לאשר את המיקום. זה נעשה על ידי השוואת תכונות אנטומיות בחתך.
6. בלוק סדרתי פנים סריקת מיקרוסקופיה אלקטרונים18
- הפחת את חתך הרוחב של הדגימה כדי להכיל SBF-SEM, כ 2.0 x 1.5 x 1.8 מ"מ.
- הרכיבו את הדגימה הקצוצה על ספח האלומיניום SBF-SEM באמצעות אפוקסי.
- מצפים את בלוק הדגימה בזהב של 35 ננומטר. סובבו את הדגימה על הרציף כדי להחיל שכבה אחידה של ציפוי.
- פתחו את תא SBF-SEM והתאמו את גובה להב הסכין לגובה אוצנטרי מיקרוסקופי.
- הכנס את הדוגמה והחלק את ספח הדגימה.
- תמונה בתנאי ואקום נמוכים למניעת טעינה ועם גלאי backscatter (ראה טבלה S2 עבור פרמטרי רכישת SBF-SEM).
- תמונה ותפירת אזורים מרובים של עניין בהגדלות שונות באמצעות תוכנה אוטומטית(ראה טבלת חומרים ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנסטומוזיס של עורק הריאות לצינורות לחצה מוצג באיור 1A. בעקבות הפעלת לחץ הידרוסטטי, תא המטען הריאתי מתנודה באופן רדיאלי(איור 1B)המציין כי עלוני שסתום הריאות נמצאים בתצורה סגורה. התאמה שסתום ריאות אושרה על ידי μCT. במקרה זה, העלונים היו coapt (סגור) ואת annulus היה מעגלי(איור 2A). איור 2B,C מראה דרגות שונות של לחץ שסתום ריאתי לקוי על ידי קיבעון (איור 2B)או קריסת עורקים (איור 2C).
חיתוך בלוק לדוגמה הונחה על-ידי עיבוד אמצעי האחסון של μCT. במקרה זה, המטוס המקביל לצומת הסיני-צינורי נבחר ככיוון הקיטוס. באמצעות ציוני דרך אנטומיים, אמצעי האחסון של μCT בעיבוד חתך וירטואלי היה בקורלציה עם תמונות אופטיות (איור 3) כדי לאשר את כיוון החתך והמיקום.
לאחר שבלוק הדגימה היה במיקום ובכיוון הרצויים, תמונות SBF-SEM ברזולוציה גבוהה צולמו באזור מקומי בתוך עלון. מתאם התמונה נעשה בין פרוסת עיבוד אמצעי האחסון הווירטואלית של μCT (איור 4A),תמונות SBF-SEM ברזולוציה נמוכה(איור 4B)לבין תמונות SBF-SEM ברזולוציה גבוהה (איור 4C). בגלל הרכבה ידנית של הדגימה, נדרשו פרוסות נדרשות של בלוק הדגימה כדי ליצור משטח שטוח לפני רכישת תמונות ב- SBF-SEM; לפיכך, המיקומים השונים בין איור 3 לאיור 4.
ניתן לראות מתאם תמונה מלא בין ערכות הנתונים של μCT ו- SBF-SEM בסרטון 1. דגימת שסתום הריאות בעיבוד נפח μCT ניתן להבחין בקלות מן שרף ההטבעה שמסביב בגלל הכתמת אטומי מתכת כבדה. אורכים וזוויות נמדדים בתמונה כדי להנחות את הניקוד. בדוגמה זו, נעשה שימוש במישור המקביל לצומת הסיני-צינורי. פרוסה וירטואלית דרך מחקה את הסרת החומר עד עומק העניין הוא הגיע. תמונות ברזולוציה גבוהה שצולמו על-ידי SBF-SEM צולמו בחתך רוחב זה ונרשמו בערכת הנתונים של μCT.
לאחר הרכישה, ניתן לייבא תמונות ברזולוציה גבוהה שצולמו על-ידי SBF-SEM למעבד תמונות ולהיערך לייצוג תלת-ממדי(איור 5)שבו ניתן לזהות רכיבים חוץ-תאיים.
איור 1: תמונות מייצגות של תא מטען ריאתי מעושן. תא המטען הריאתי הנרגש (A) לפני ו -B) לאחר לחץ הידרוסטטי. הקו המקווקו מציין את צומת פיתום-עורקים שבו אנולוס של גזע הריאות שוכן. שימו לב לתנופת תא המטען הריאתי בעת לחץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שסתום ריאתי ריאתי של נפח μCT מייצג. (A)שסתום הריאות נמצא במצב סגור עם העלונים מתוחים כראוי ו coapt (מעגל). (B,C) לחץ לקוי של שסתום הריאות. שים לב שהעלונים אינם coapt כראוי (B) וכי annulus אינו מעגלי (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מתאם תמונה של בלוק דגימת שסתום ריאות. (A)נפח μCT עיבוד פרוסה וירטואלית ו - (B)בלוק דגימה פיזית לאחר חיתוך נלקח על ידי מיקרוסקופיה אופטית. חלקים של עלוני שסתום ריאות מוקפים באדום ושימשו כציוני דרך כדי לתאם את שתי שיטות ההדמיה השונות. סרגל קנה המידה מתאים ל- 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מתאם תמונה של חתך שסתום ריאות בתמונה. (A)חתך רוחב וירטואלי שנוצר על-ידי עיבוד אמצעי אחסון של μCT. תיבה אדומה מציינת את האזור שצוולם באמצעות SBF-SEM ב- (B). (B)תמונות מבט כולל ברזולוציה נמוכה כדי לתאם עם חתך רוחב μCT. תיבה כחולה מייצגת את המיקום של (C)הדמיית SBF-SEM ברזולוציה גבוהה. סרגלי קנה מידה תואמים ל -B) 100 מיקרומטר ו -C) 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אזור מקוטע של שסתום הריאות שנלקח על ידי SBF-SEM. תמונות חתך נערמו והידור כדי ליצור ייצוג 3D של אזור שסתום ריאות מקומי. תוויות הוקצו לתאי אנדותל (ירוק), תאים ביניים valvular (כחול), וסיבים חוץ תאיים (צהוב). הממדים המשוערים של האזור המוצהם הם 30 מיקרומטר x 20 מיקרומטר x 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| פוטנציאל צינור | 70 קילו-בתים |
| זרם צינור | 75 μA |
| מצב מיקוד | M |
| מסלול | סיבובי |
| תחזיות/מהפכה | 2880 |
| מצב | 3040 x 3040 px |
| ממוצע | 1 |
| זמן חשיפה | 1.0 s |
| מרחק מדגם לאקדח | 15 מ"מ |
| מרחק גלאי לאקדח | 725 מ"מ |
| גודל ווקסל | 2.9 מיקרומטר |
| שדה תצוגה | 8.4 x 8.4 x 6.3 מ"מ |
טבלה S1: פרמטרי הדמיה עבור μCT.
| אנרגיית נחיתה | 2 - 2.5 קילו-בתים |
| זרם קרן | 100 - 400 pA |
| מרחק עבודה | 6.5 - 7 מ"מ |
| גלאי | VS-DBS |
| זמן השתהות | 1 - 2 מיקרו |
טבלה S2: פרמטרי הדמיה עבור SBF-SEM.
וידאו 1: תיקון תמונה של ערכות נתונים של μCT ו- SBF-SEM. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הסרת החדרים משרתת שתי מטרות. ראשית, חשיפת צד החדר ללחץ האטמוספרי, ובכך רק צריך להפעיל לחץ transvalvular מהצד העורקי של שסתום הריאות כדי לסגור, ושנית, מתן בסיס יציב כדי למנוע פיתול של גזע הריאות. במהלך לחץ, תא המטען הריאתי נפסק באופן רדיאלי ונחות, מה שהופך אותו נוטה פיתול, גרימת קריסה של תא המטען הריאתי. טעינה מראש של שסתום הריאות עם תמיסת מלח מציעה בדיקת איכות נוספת כדי להבטיח כי לחץ הוא מספיק ואם יש דליפות במערכת. הפעולה של הקיבעון העיקרי היא מהירה, בסדר של כמה שניות, וללא preloading הידרוסטטי עם תמיסת מלח, שסתום הריאות קבוע בקונפורמציה אקראית. ללא טעינה מראש, שיעור ההצלחה של שסתום ריאות סגור היה סביב 10%-20%. עם שלב הטעינה מראש, שיעור ההצלחה היה מעל 90%.
תנאי ההדמיה של μCT ו- SBF-SEM היו מכוונים עבור יישום זה. שסתום הריאות, כאשר נמתח במלואו, יכול להיות פחות מ 10 מיקרומטר עובי. ככלל אצבע, נדרש סף של 3 voxels כדי להיות מסוגל לפתור תכונה; כך שתרגושי נפח ה-μCT נסרקו בגודל ווקסל של 2.9 מיקרומטר עם שדה ראייה של 8.4 x 8.4 x 6.3 מ"מ. גדלי voxel קטנים יותר ניתן להשיג μCT אבל זה דורש גם חיתוך מדגם ו /או זמני סריקה ארוכים יותר. מדגם קטן יותר יאפשר רזולוציה גבוהה יותר על ידי הצבתו קרוב יותר למקור הרנטגן. voxels קטן יותר ניתן להשיג גם על ידי הצבת גלאי הרנטגן רחוק יותר מן המדגם; עם זאת, זה יקטין את השטף הכולל על הגלאי ולפגוע יחס אות לרעש. כהתייחסות, סריקות ה- μCT שלנו היו בערך 5-6 שעות במשך. תנאי הדמיה ספציפיים המשמשים במחקר זה נמצאים בטבלה משלימה S1 ושולחן משלים S2).
קיימות מגבלות לשיטה זו. החלק הכירורגי של הליך זה דורש מומחיות בטיפול בבעלי חיים כדי לא להתפשר על מבנה שסתום הריאות בזמן הטיפול. בנוסף, ההדמיה היא עתירת זמן ודורשת מכשירי הדמיה מרובים. כהתייחסות, הדמיית SBF-SEM ברזולוציה גבוהה הייתה כשבוע של הדמיה רציפה לעומק של כ -100 מיקרומטר. זוהי משימה תובענית עבור המכשיר להישאר יציב ועקבי עבור מפגשי הדמיה ארוכים. גישה מעשית יותר תהיה לתכנן אסטרטגיית דגימה כדי לתאר במדויק את ההטרוגניות של שסתום הריאות ללא השקעת זמן. זה עדיין לא נקבע. עד כה, כל זרימת העבודה המתאם נעשה על עכבר אחד אבל הראה את ההיתכנות והפוטנציאל של זרימת העבודה המתאם בחקירת שסתום הריאות על פני קשקשי אורך.
איטרציות עתידיות של גישה קורלטיבית זו עשויות להיות כרוכות בניסויי μCT במקום, כך שאותה דגימה יכולה להיחשף ללחץ טרנס-valvular שונה כדי להסיר וריאציה מדגם לדגימה. זה מוגבל כיום על ידי מדגם ויציבות מכשירים עבור זמני סריקה מורחבים, מנגנון לחץ המשולב במערכות הדמיה, וניגודיות בשל מקדמי ההנחיה דומים של מים ורקמות. בנוסף, למרות הלחצים transvalvular היו משקפים של תנאים פיזיולוגיים, זה לא מייצג את הזרימה הפועמת האופיינית התכווצות הלב. עם זאת, הוכח כי שיעור המתח יש השפעה מועטה על הקונפורמציה של העלון. באיטרציות עתידיות, זה עשוי להתברר רלוונטי יותר להנדס מכשיר המסוגל לנהל זרימה פועמת9. בנוסף, חלק גדול מהעבודה דורש חקירה ידנית של המדגם, שכן כרגע אין זרימת עבודה אוטומטית. איתור שסתום הריאות, עיבוד מדגם לכיוון אזור העניין, מתאם התמונה והרישום נעשו באופן ידני, אך יתבררו כיעילים בעתיד לייעול העיבוד ולצמצום הסובייקטיביות.
העבודה המוצגת היא זרימת עבודה מתאם לתיקון ההתאמה של שסתום הריאות ורישום הדמיה ב- μCT ו- SBF-SEM. המידע המתקבל בשיטה זו ישמש בסופו של דבר כדי לקבוע את הביומכניקה הבסיסית של שסתום הריאות במודלים של בעלי חיים מורינים, אשר טרם התבהרו. ביומכניקה Valvular ניתן לתאר לחלוטין על ידי הגיאומטריה שלה מטריצה חוץ תאית, אבל אלה הם בשני סולמות אורך שונים. כדי לעשות זאת, שליטה מדויקת של ההטרוגניות של השסתום ומיפוי מדויק של תמונות ברזולוציה גבוהה של המטריצה החוץ תאית ביחס למיקומו בתוך שסתום הריאות יש צורך. זרימת עבודה קורלטיבית זו כבר מיושמת בניסויים אחרים כדי לצייר השוואות בין עכברי אוסטוגנזה אוסטוגנזה מהונדסים כדי להשוות הבדלי מטריצה חוץ-תאית פיברילר וניתן לשער בקלות פגמים מולדים אחרים כגון היווצרות שסתום bicuspid19,20. מידע זה בשילוב עם פרוטאומיקס אפשרי יספק תמונה מלאה של האופן שבו הביומכניקה תהיה שונה בין שני המודלים של בעלי החיים המוריניים.
למרות עבודה זו רק המתארת את שסתום הריאות, זרימת עבודה זו ניתנת לתיקון בקלות למערכות ביולוגיות הטרוגניות והיררכיות אחרות. השתמשנו בטכניקות הדמיה תלת-ממדיות כדי ללכוד את הארגון האדריכלי של ה- ECM, אך ניתן לצרף טכניקות ברזולוציה גבוהה יותר, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור או סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור, בהתאם למידע הרצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת, בין השאר, על ידי R01HL139796 ומענקי R01HL128847 ל- CKB ו- RO1DE028297 ו- CBET1608058 עבור DWM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , CRC Press. (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
