Cirugía y procesamiento de muestras para imágenes correlativas de la válvula pulmonar murina
Summary
Aquí, describimos un flujo de trabajo correlativo para la escisión, presurización, fijación e imágenes de la válvula pulmonar murina para determinar la conformación macróstica y las estructuras locales de la matriz extracelular.
Abstract
Las causas subyacentes de la enfermedad relacionada con las válvulas cardíacas (HVD) son esquivas. Los modelos animales murinos proporcionan una excelente herramienta para estudiar la HVD, sin embargo, la experiencia quirúrgica e instrumental requerida para cuantificar con precisión la estructura y la organización en múltiples escalas de longitud han atrofiado su avance. Este trabajo proporciona una descripción detallada de la disección murina, la tinción en bloque, el procesamiento de muestras y los procedimientos de imágenes correlativas para representar la válvula cardíaca en diferentes escalas de longitud. Se utilizó presión transvalvular hidrostática para controlar la heterogeneidad temporal mediante la fijación química de la conformación de la válvula cardíaca. Se utilizó la tomografía micro computarizada (μCT) para confirmar la geometría de la válvula cardíaca y proporcionar una referencia para el procesamiento de muestras aguas abajo necesario para la microscopía electrónica de barrido facial en bloque serie (SBF-SEM). Se tomaron y reconstruyeron imágenes SEM en serie de alta resolución de la matriz extracelular (ECM) para proporcionar una representación 3D local de su organización. Los métodos de imagen μCT y SBF-SEM se correlacionaron para superar la variación espacial a través de la válvula pulmonar. Aunque el trabajo presentado es exclusivamente sobre la válvula pulmonar, esta metodología podría adoptarse para describir la organización jerárquica en sistemas biológicos y es fundamental para la caracterización estructural a través de múltiples escalas de longitud.
Introduction
La válvula pulmonar (PV) sirve para asegurar el flujo sanguíneo unidireccional entre el ventrículo derecho y la arteria pulmonar. Las malformaciones de la válvula pulmonar se asocian con varias formas de cardiopatía congénita. El tratamiento actual para la enfermedad congénita de la válvula cardíaca (HVD) es la reparación valvular o el reemplazo de la válvula, que puede requerir múltiples cirugías invasivas a lo largo de la vida de un paciente1. Se ha aceptado ampliamente que la función de la válvula cardíaca se deriva de su estructura, a menudo conocida como el correlato estructura-función. Más específicamente, las propiedades geométricas y biomecánicas del corazón dictan su función. Las propiedades mecánicas, a su vez, están determinadas por la composición y organización del ECM. Mediante el desarrollo de un método para determinar las propiedades biomecánicas de las válvulas cardíacas murinas, se pueden utilizar modelos animales transgénicos para interrogar el papel de la ECM en la función y disfunción de las válvulas cardíacas2,3,4,5.
El modelo animal murino ha sido considerado durante mucho tiempo como el estándar para los estudios moleculares porque los modelos transgénicos están más fácilmente disponibles en ratones en comparación con otras especies. Los modelos transgénicos murinos proporcionan una plataforma versátil para la investigación de enfermedades relacionadas con las válvulas cardíacas6. Sin embargo, la experiencia quirúrgica y los requisitos de instrumentación para caracterizar tanto la geometría como la organización de ECM han sido un obstáculo importante en el progreso de la investigación de HVD. Los datos hstológicos en la literatura proporcionan una imagen del contenido de la matriz extracelular de la válvula cardíaca murina, pero solo en forma de imágenes 2D, y no pueden describir su arquitectura 3D7,8. Además, la válvula cardíaca es heterogénea tanto espacial como temporalmente, lo que dificulta sacar conclusiones a través de los experimentos con respecto a la organización de la ECM si el muestreo y la conformación no son fijos. Los métodos convencionales de caracterización 3D, como la resonancia magnética o la ecocardiografía 3D, no proporcionan la resolución necesaria para resolver los componentes de ecm9,10.
Este trabajo detalla un flujo de trabajo totalmente correlativo donde se abordó la heterogeneidad temporal debida al ciclo cardíaco fijando la conformación de la PV murina con presión transvalvular hidrostática. La heterogeneidad espacial se controló con precisión mediante el muestreo de regiones de interés y el registro de conjuntos de datos de diferentes modalidades de imagen, específicamente μCT y microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie, a través de diferentes escalas de longitud. Este método de exploración con μCT para guiar el muestreo aguas abajo se ha propuesto anteriormente, pero debido a que la válvula pulmonar exhibe variación temporal, se necesitaba un nivel adicional de control en el nivel quirúrgico11.
Los estudios in vivo que describen la biomecánica de la válvula cardíaca murina son escasos y, en cambio, se basan en modelos computacionales al describir el comportamiento de deformación. Es de vital importancia que los datos extracelulares locales en la escala de longitud nanométrica estén relacionados con la geometría y la ubicación de la válvula cardíaca. Esto, a su vez, proporciona distribuciones cuantificables y mapeadas espacialmente de proteínas ECM que contribuyen mecánicamente, que se pueden utilizar para reforzar los modelos biomecánicos existentes de válvulas cardíacas12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
La extirpación de los ventrículos sirve para dos propósitos. Primero, exponer el lado del ventrículo a la presión atmosférica, por lo que solo necesita aplicar una presión transvalvular desde el lado arterial de la válvula pulmonar para cerrar, y segundo, proporcionar una base estable para evitar la torsión del tronco pulmonar. Durante la presurización, el tronco pulmonar se distiende radial e inferiormente, haciéndolo propenso a torcerse, causando el colapso del tronco pulmonar. La precarga de la válvula pul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está respaldado, en parte, por las subvenciones R01HL139796 y R01HL128847 a CKB y RO1DE028297 y CBET1608058 para DWM.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
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