Chirurgia ed elaborazione dei campioni per l'imaging correlativo della valvola polmonare murina
Summary
Qui, descriviamo un flusso di lavoro correlativo per l’escissione, la pressurizzazione, la fissazione e l’imaging della valvola polmonare murina per determinare la conformazione grossolana e le strutture locali della matrice extracellulare.
Abstract
Le cause alla base della malattia correlata alle valvole cardiache (HVD) sono sfuggenti. I modelli animali murini forniscono uno strumento eccellente per studiare l’HVD, tuttavia, le competenze chirurgiche e strumentali necessarie per quantificare con precisione la struttura e l’organizzazione su più scale di lunghezza hanno stentato il suo avanzamento. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della dissezione murina, della colorazione in blocco, dell’elaborazione del campione e delle procedure di imaging correlative per rappresentare la valvola cardiaca a diverse scale di lunghezza. La pressione idrostatica transvalvolare è stata utilizzata per controllare l’eterogeneità temporale fissando chimicamente la conformazione della valvola cardiaca. La tomografia microcinesca (μCT) è stata utilizzata per confermare la geometria della valvola cardiaca e fornire un riferimento per l’elaborazione del campione a valle necessaria per la microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali (SBF-SEM). Le immagini SEM seriali ad alta risoluzione della matrice extracellulare (ECM) sono state prese e ricostruite per fornire una rappresentazione 3D locale della sua organizzazione. I metodi di imaging μCT e SBF-SEM sono stati quindi correlati per superare la variazione spaziale attraverso la valvola polmonare. Sebbene il lavoro presentato sia esclusivamente sulla valvola polmonare, questa metodologia potrebbe essere adottata per descrivere l’organizzazione gerarchica nei sistemi biologici ed è fondamentale per la caratterizzazione strutturale su più scale di lunghezza.
Introduction
La valvola polmonare (PV) serve a garantire il flusso sanguigno unidirezionale tra il ventricolo destro e l’arteria polmonare. Le malformazioni della valvola polmonare sono associate a diverse forme di cardiopatia congenita. L’attuale trattamento per la cardiopatia congenita delle valvole cardiache (HVD) è la riparazione valvolare o la sostituzione della valvola, che può richiedere più interventi chirurgici invasivi per tutta la vita di un paziente1. È stato ampiamente accettato che la funzione della valvola cardiaca deriva dalla sua struttura, spesso indicata come il correlato struttura-funzione. Più specificamente, le proprietà geometriche e biomeccaniche del cuore ne dettano la funzione. Le proprietà meccaniche, a loro volta, sono determinate dalla composizione e dall’organizzazione dell’ECM. Sviluppando un metodo per determinare le proprietà biomeccaniche delle valvole cardiache murine, i modelli animali transgenici possono essere utilizzati per interrogare il ruolo dell’ECM sulla funzione e la disfunzione della valvola cardiaca2,3,4,5.
Il modello animale murino è stato a lungo considerato lo standard per gli studi molecolari perché i modelli transgenici sono più facilmente disponibili nei topi rispetto ad altre specie. I modelli transgenici murini forniscono una piattaforma versatile per la ricerca di malattie correlate alle valvole cardiache6. Tuttavia, le competenze chirurgiche e i requisiti di strumentazione per caratterizzare sia la geometria che l’organizzazione ECM sono stati un grosso ostacolo nel progresso della ricerca HVD. I dati istologici in letteratura forniscono un’immagine nel contenuto della matrice extracellulare della valvola cardiaca murina, ma solo sotto forma di immagini 2D e non sono in grado di descrivere la sua architettura 3D7,8. Inoltre, la valvola cardiaca è sia spazialmente che temporalmente eterogenea, rendendo difficile trarre conclusioni tra gli esperimenti riguardanti l’organizzazione ECM se il campionamento e la conformazione non sono fissi. I metodi di caratterizzazione 3D convenzionali, come la risonanza magnetica o l’ecocardiografia 3D, non forniscono la risoluzione necessaria per risolvere i componenti ECM9,10.
Questo lavoro descrive un flusso di lavoro completamente correlato in cui l’eterogeneità temporale dovuta al ciclo cardiaco è stata affrontata fissando la conformazione del PV murino con la pressione idrostatica transvalvolare. L’eterogeneità spaziale è stata controllata con precisione campionando le regioni di interesse e registrando set di dati da diverse modalità di imaging, in particolare μCT e microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali, su diverse scale di lunghezza. Questo metodo di scouting con μCT per guidare il campionamento a valle è stato proposto in precedenza, ma poiché la valvola polmonare presenta variazioni temporali, è stato necessario un ulteriore livello di controllo sul livello chirurgico11.
Gli studi in vivo che descrivono la biomeccanica della valvola cardiaca murina sono scarsi e, invece, si basano su modelli computazionali quando descrivono il comportamento di deformazione. È di fondamentale importanza che i dati extracellulari locali sulla scala di lunghezza nanometrica siano correlati alla geometria e alla posizione della valvola cardiaca. Questo, a sua volta, fornisce distribuzioni quantificabili e mappate spazialmente di proteine ECM che contribuiscono meccanicamente, che possono essere utilizzate per rafforzare i modelli di valvole cardiache biomeccaniche esistenti12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
La rimozione dei ventricoli serve a due scopi. In primo luogo, esponendo il lato del ventricolo alla pressione atmosferica, quindi è sufficiente applicare una pressione transvalvolare dal lato arterioso della valvola polmonare per chiudere, e in secondo luogo, fornendo una base stabile per prevenire la torsione del tronco polmonare. Durante la pressurizzazione, il tronco polmonare si distende radialmente e inferiormente, rendendolo incline alla torsione, causando il collasso del tronco polmonare. Il precaricamento della…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato, in parte, dalle sovvenzioni R01HL139796 e R01HL128847 a CKB e RO1DE028297 e CBET1608058 per DWM.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
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