JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Pinzette ottiche per studiare le interazioni RNA-proteina nella regolazione della traduzione

Published: February 12, 2022
doi:
10.3791/62589
, ,
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI),Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty,Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro sperimentale completo per lo studio delle interazioni RNA-proteina utilizzando pinzette ottiche. Sono delineate diverse possibili configurazioni sperimentali, tra cui la combinazione di pinzette ottiche con microscopia confocale.

Abstract

L’RNA adotta diverse pieghe strutturali, che sono essenziali per le sue funzioni e quindi possono avere un impatto su diversi processi nella cellula. Inoltre, la struttura e la funzione di un RNA possono essere modulate da vari fattori trans-agenti, come proteine, metaboliti o altri RNA. Le molecole di RNA frameshifting, ad esempio, sono RNA regolatori situati in regioni codificanti, che dirigono la traduzione dei ribosomi in un frame di lettura aperto alternativo, e quindi agiscono come interruttori genici. Possono anche adottare pieghe diverse dopo il legame a proteine o altri fattori trans. Per analizzare il ruolo delle proteine leganti l’RNA nella traduzione e il modo in cui modulano la struttura e la stabilità dell’RNA, è fondamentale studiare contemporaneamente l’interazione e le caratteristiche meccaniche di questi complessi RNA-proteina. Questo lavoro illustra come impiegare pinzette ottiche accoppiate a singola molecola-fluorescenza per esplorare il panorama conformazionale e termodinamico dei complessi RNA-proteina ad alta risoluzione. Ad esempio, viene elaborata l’interazione dell’elemento di frameshifting ribosomiale programmato SARS-CoV-2 con l’isoforma breve del fattore trans-agente della proteina antivirale zinco-dito. Inoltre, i ribosomi marcati con fluorescenza sono stati monitorati utilizzando l’unità confocale, che alla fine avrebbe permesso lo studio dell’allungamento della traduzione. Il test OT accoppiato a fluorescenza può essere ampiamente applicato per esplorare diversi complessi RNA-proteina o fattori trans-agenti che regolano la traduzione e potrebbe facilitare gli studi sulla regolazione genica basata sull’RNA.

Introduction

Il trasferimento di informazioni genetiche dal DNA alle proteine attraverso gli mRNA è un processo biochimico complesso, che è regolato con precisione a tutti i livelli attraverso interazioni macromolecolari all’interno delle cellule. Per la regolazione traslazionale, le interazioni RNA-proteina conferiscono un ruolo critico per reagire rapidamente a vari stimoli e segnali1,2. Alcune interazioni RNA-proteina influenzano la stabilità dell’mRNA e quindi alterano il tempo in cui un RNA è attivo per via traslazionale. Altre interazioni RNA-proteina sono associate a meccanismi di ricodifica come il readthrough stop-codone, il bypassing o il frameshifting ribosomiale programmato (PRF)3,4,5,6,7. Recentemente, un certo numero di proteine leganti l’RNA (RBP) hanno dimostrato di interagire con gli elementi dell’mRNA stimolatorio e il meccanismo di traduzione per dettare quando e quanta ricodifica si verificherà nella cellula7,8,9,10,11. Pertanto, per analizzare il ruolo delle proteine leganti l’RNA nella traduzione e il modo in cui modulano la struttura e la stabilità dell’RNA, è fondamentale studiare in dettaglio i principi di interazione e le proprietà meccaniche di questi complessi RNA-proteina.

Decenni di lavoro hanno gettato le basi per studiare il processo di traduzione multi-fase e multi-componente, che si basa su una comunicazione intricata tra l’RNA e i componenti proteici del meccanismo di traduzione per raggiungere velocità e precisione12,13,14. Un passo successivo cruciale nella comprensione di eventi normativi complessi è determinare le forze, i tempi e i determinanti strutturali durante la traduzione ad alta precisione12,15,16,17. Lo studio della dinamica conformazionale dell’RNA e in particolare di come i fattori ausiliari trans-agenti agiscono sulla struttura dell’RNA durante la traslazione sono stati ulteriormente illuminati dall’emergere di strumenti a singola molecola, tra cui pinzette ottiche o guide d’onda in modalità zero16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Le pinzette ottiche (OT) rappresentano una tecnica a singola molecola altamente precisa, che è stata applicata per studiare molti tipi di processi dinamici dipendenti dall’RNA, tra cui la trascrizione e la traduzione26,27,28,29,30,31,32. L’uso di pinzette ottiche ha permesso di sondare in dettaglio le interazioni molecolari, le strutture degli acidi nucleici e le proprietà termodinamiche, la cinetica e l’energetica di questi processi16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Il test delle pinzette ottiche si basa sull’intrappolamento di oggetti microscopici con un raggio laser focalizzato. In un tipico esperimento OT, la molecola di interesse è legata tra due perle trasparenti (di solito polistirene) (Figura 1A)27. Queste perle vengono poi catturate da trappole ottiche, che si comportano come molle. Pertanto, la forza applicata sulla molecola può essere calcolata in base allo spostamento del tallone dal centro del raggio laser focalizzato (centro trappola). Recentemente, le pinzette ottiche sono state combinate con la microscopia confocale (Figura 1B), consentendo misurazioni di fluorescenza o trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) 40,41,42. Questo apre un campo completamente nuovo di possibili esperimenti che consentono la misurazione simultanea e, quindi, una correlazione precisa della spettroscopia di forza e dei dati di fluorescenza.

Qui, dimostriamo esperimenti che utilizzano le pinzette ottiche combinate con la microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-RNA che regolano il frameshifting traslazionale. Tra l’obiettivo e il condensatore, una cella di flusso con cinque canali consente l’applicazione continua del campione con flusso laminare. Attraverso i canali microfluidici, vari componenti possono essere iniettati direttamente, il che riduce il tempo di hands-on e consente un consumo di campioni molto ridotto durante l’esperimento.

In primo luogo, viene proposta una linea guida di base per assistere la progettazione di esperimenti OT e vengono discussi i vantaggi e le insidie di varie configurazioni. Successivamente, viene descritta la preparazione di campioni e flussi di lavoro sperimentali e viene fornito un protocollo per l’analisi dei dati. Per rappresentare un esempio, delineiamo i risultati ottenuti da esperimenti di stretching dell’RNA per studiare l’elemento RNA frameshifting SARS-CoV-2 (Figura 2A) con il fattore trans-agente l’isoforma corta della proteina antivirale zinco-dito (ZAP), che altera la traduzione dell’RNA virale da un frame di lettura alternativo43. Inoltre, è dimostrato che i ribosomi marcati con fluorescenza possono essere impiegati in questo saggio confocale OT, che sarebbe utile per monitorare la processività e la velocità del macchinario di traduzione. Il metodo qui presentato può essere utilizzato per testare rapidamente l’effetto di diversi tamponi, ligandi o altri componenti cellulari per studiare vari aspetti della traduzione. Infine, vengono discusse le insidie sperimentali comuni e come risolverle. Di seguito, vengono delineati alcuni punti cruciali nella progettazione sperimentale.

Progettazione di costruzioni
In linea di principio, ci sono due approcci comuni per creare un costrutto di RNA compatibile ot. Il primo approccio impiega una lunga molecola di RNA che viene ibridata con maniglie di DNA complementari, producendo così un costrutto costituito da due regioni ibride RNA / DNA che fiancheggiano una sequenza di RNA a singolo filamento nel mezzo (Figura 2B). Questo approccio è impiegato nella maggior parte degli esperimenti ot RNA33,44,45.

Il secondo approccio sfrutta le maniglie dsDNA con sporgenze corte (circa 20 nt)15,17. Queste sporgenze vengono poi ibridate con la molecola di RNA. Sebbene più complicato nella progettazione, l’uso di maniglie dsDNA supera alcune delle limitazioni del sistema ibrido DNA / RNA. In linea di principio, è possibile implementare anche maniglie molto lunghe (>10kb), il che è più conveniente per le misurazioni confocali. Inoltre, la molecola di RNA può essere legata alle maniglie del DNA per aumentare la stabilità del legame.

Strategia di etichettatura finale
Il costrutto deve essere legato a perline tramite una forte interazione molecolare. Mentre ci sono approcci disponibili per il legame covalente delle maniglie alle perline46, interazioni forti ma non covalenti come streptavidina-biotina e digoxigenina-anticorpo sono comunemente usate negli esperimenti OT15,33,35,45. Nel protocollo descritto, il costrutto è etichettato con biotina o digossigenina e le perline sono rivestite rispettivamente con streptavidina o anticorpi contro la digossigenina (Figura 1A). Questo approccio sarebbe adatto per applicare forze fino a circa 60 pN (per tether)47. Inoltre, l’uso di diverse strategie di etichettatura 5′ e 3′ consente di determinare l’orientamento del cavo formato tra le perline17.

Etichettatura delle proteine per misure di fluorescenza
Per l’imaging confocale, ci sono diversi approcci comunemente usati per l’etichettatura a fluorescenza. Ad esempio, i fluorofori possono essere attaccati covalentemente a residui di amminoacidi che si trovano nativamente nelle proteine o introdotti dalla mutagenesi diretta dal sito attraverso un gruppo organico reattivo. I coloranti tiolici o ammino-reattivi possono essere utilizzati per l’etichettatura dei residui di cisteina e lisina, rispettivamente. Esistono diversi metodi di protezione reversibili per aumentare la specificità dell’etichettatura48,49, tuttavia le proteine native sarebbero tipicamente etichettate a più residui. Sebbene le piccole dimensioni del fluoroforo possano conferire un vantaggio, l’etichettatura non specifica potrebbe interferire con l’attività proteica e quindi l’intensità del segnale potrebbe variare49. Inoltre, a seconda dell’efficienza di etichettatura, l’intensità del segnale può differire tra i diversi esperimenti. Pertanto, un controllo dell’attività deve essere eseguito prima dell’esperimento.

Nel caso in cui la proteina di interesse contenga un tag N- o C-terminale, come un His-tag o strep-tag, l’etichettatura specifica di questi tag rappresenta un altro approccio popolare. Inoltre, l’etichettatura mirata ai tag riduce la possibilità che il fluoroforo interferisca con l’attività proteica e può migliorare la solubilità49. Tuttavia, l’etichettatura specifica del tag di solito produce proteine marcate con monofluoroforo, che potrebbero essere difficili da rilevare. Un altro modo di etichettatura specifica può essere realizzato impiegando anticorpi.

Configurazione della microfluidica
La combinazione di OT con un sistema di microfluidica consente una rapida transizione tra diverse condizioni sperimentali. Inoltre, i sistemi di corrente sfruttano il mantenimento del flusso laminare all’interno della cella di flusso, che preclude la miscelazione di liquidi da altri canali nella direzione perpendicolare rispetto alla direzione del flusso. Pertanto, il flusso laminare è particolarmente vantaggioso per la progettazione sperimentale. Attualmente, le celle di flusso con un massimo di 5 canali sono comunemente utilizzate (Figura 3).

Protocol

1. Preparazione del campione Clonare la sequenza di interesse nel vettore contenente i frammenti di DNA Lambda, che fungono da sequenze di maniglia (Figura 2)43,50. Per prima cosa generare un modello di DNA per la successiva trascrizione in vitro tramite PCR (Figura 2B; reazione 1). In questa fase della PCR, il promotore T7 viene aggiunto all’estremità 5′ de…

Representative Results

In questa sezione, l’attenzione si concentra principalmente sulle misurazioni delle interazioni RNA-proteina/ligando da parte delle pinzette ottiche a fluorescenza. Per una descrizione degli esperimenti generali sulle pinzette ottiche a RNA e dei corrispondenti risultati rappresentativi, vedere32. Per una discussione più dettagliata delle interazioni RNA/DNA-proteina, vedere anche1,2,26,59,60….

Discussion

Qui, dimostriamo l’uso di pinzette ottiche accoppiate a fluorescenza per studiare le interazioni e il comportamento dinamico delle molecole di RNA con vari ligandi. Di seguito, vengono discussi i passaggi critici e le limitazioni della presente tecnica.

Passaggi critici nel protocollo
Come per molti altri metodi, la qualità del campione è fondamentale per ottenere dati affidabili. Pertanto, per ottenere campioni della massima qualità possibile, vale la pena dedicare del …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Anuja Kibe e Jun. Prof. Redmond Smyth per aver esaminato criticamente il manoscritto. Ringraziamo Tatyana Koch per l’assistenza tecnica esperta. Ringraziamo Kristyna Pekarkova per l’aiuto nella registrazione di video sperimentali. Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato dall’Associazione Helmholtz e dal finanziamento della sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca (CER) Nr. 948636 (a NC).

Materials

Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096 (2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172 (2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582 (2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler’s murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406 (2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O’Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714 (2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799 (2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O’Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23 (2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542 (2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500 (2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549 (2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484 (2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193 (2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137 (2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795 (1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166 (2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110 (2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246 (2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272 (2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749 (2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Tags

Optical TweezersRNA-protein InteractionsTranslation RegulationSingle Molecule TechniquesFluorescence Assisted Optical TweezersForce-ramp ExperimentsConstant Force MeasurementsReal-time VisualizationDNA-RNA ConstructIn-vitro TranscriptionPCR Reactions
check_url/62589?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image