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Biochemistry

번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

Published: February 12, 2022
doi:
10.3791/62589
, ,
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI),Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty,Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

이 프로토콜은 광학 핀셋을 사용하여 RNA 단백질 상호 작용을 연구하기위한 완벽한 실험 워크플로우를 제공합니다. 공초점 현미경 검사법과 광학 핀셋의 조합을 포함하여 몇 가지 가능한 실험 설정이 설명되어 있습니다.

Abstract

RNA는 기능에 필수적인 다양한 구조 접을 채택하여 세포의 다양한 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, RNA의 구조 및 기능은 단백질, 대사산물 또는 기타 RNA와 같은 다양한 트랜스 작용 요인에 의해 변조될 수 있다. 프레임 변속 RNA 분자는, 예를 들면, 다른 개방독서 프레임으로 리보솜을 직접 번역하는 코딩 지구에 있는 규제 RNA이고, 그 에 의해 유전자 스위치로 작동합니다. 그(것)들은 또한 단백질 또는 그밖 트랜스 인자에 결합한 후에 다른 주름을 채택할 수 있습니다. 번역에서 RNA 결합 단백질의 역할을 해부하고 RNA 구조와 안정성을 조절하는 방법을 해부하기 위해 이러한 RNA 단백질 복합체의 상호 작용 및 기계적 특징을 동시에 연구하는 것이 중요합니다. 이 연구는 단일 분자 형광 결합 광학 핀셋을 사용하여 고해상도로 RNA 단백질 복합체의 형성 및 열역학 적 풍경을 탐구하는 방법을 보여줍니다. 예를 들어, ZS-CoV-2 프로그래밍된 리보소말 프레임 변속 요소와 아연 핑거 항바이러스 단백질의 짧은 이소폼을 결합한 상호작용이 정교화된다. 또한, 형광 라벨리보솜은 공초점 유닛을 사용하여 모니터링하여 궁극적으로 번역 신장의 연구를 가능하게 했습니다. 형광 결합 OT 분석은 다양한 RNA 단백질 복합체 또는 번역을 조절하는 트랜스 작용 인자를 탐구하기 위해 널리 적용 될 수 있으며 RNA 기반 유전자 조절의 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

Introduction

MRNAs를 통해 DNA에서 단백질로 유전 정보의 전송은 세포 내의 거대 분자 상호 작용을 통해 모든 수준에서 정확하게 규제되는 복잡한 생화학 과정입니다. 번역 조절을 위해 RNA-단백질 상호 작용은 다양한 자극및 신호1,2에 신속하게 반응하는 중요한 역할을 부여합니다. 일부 RNA 단백질 상호 작용은 mRNA 안정성에 영향을 미치고 따라서 RNA가 번역 활성시간을 변경합니다. 그밖 RNA 단백질 상호 작용은 정지 코돈 판독과 같은 재코딩 기계장치와 연관됩니다, 우회, 또는 프로그램된 리보소말 프레임 변속 (PRF)3,4,5,6,7. 최근에는 다수의 RNA 결합 단백질(RBP)이 자극성 mRNA 원소 및 번역 기계와 상호 작용하여 셀7,8,9,10,11에서 언제 그리고 얼마나 많은 재코딩이 발생할지 지시하는 것으로 입증되었다. 따라서, 번역에서 RNA 결합 단백질의 역할을 해부하고 RNA 구조 및 안정성을 조절하는 방법, 이러한 RNA-단백질 복합체의 상호 작용 원리 및 기계적 특성을 자세히 연구하는 것은 중추적인 것이다.

수십 년의 작업은 속도와 정확성을 달성하기 위해 번역 기계의 RNA와 단백질 구성 요소 사이의 복잡한 통신에 의존하는 다단계 및 다중 구성 요소 번역 과정을 연구하는 토대를 마련했습니다12,13,14. 복잡한 규제 이벤트를 이해하는 중요한 다음 단계 는 고정밀12,15,16,17에서 번역 하는 동안 힘, 기간 및 구조 결정자를 결정 하는. RNA 형태 역학및 특히 번역 도중 RNA 구조 에 작용하는 트랜스 작용 보조 요인의 연구는 광학 핀셋 또는 제로 모드 파도관을 포함하여 단하나 분자 공구의 출현에 의해 더 조명되었습니다16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

광학 핀셋(OT)은 매우 정밀한 단일 분자 기법을 나타내며, 전사를 포함한 많은 종류의 RNA 의존적 동적 공정을 연구하고, 번역26,27,28,29,30,31,32를 연구한다. 광학 핀셋의 사용은 분자 상호 작용, 핵산 구조 및 열역학 적 특성, 운동학 및 이러한 공정의 정력적 16,17,17,22,34,35,35,37,38,38,39의 탐구를 허용했습니다. . 광학 핀셋 분석은 집중 된 레이저 빔과 미세한 물체의 함정을 기반으로합니다. 일반적인 OT 실험에서, 관심 있는 분자는 2개의 투명한 (일반적으로 폴리스티렌) 구슬 사이 테더드됩니다 (그림 1A)27. 이 구슬은 스프링처럼 행동 광학 트랩에 의해 잡힐 수 있습니다. 따라서, 분자상에 가해지는 힘은 집중된 레이저 빔(trap center)의 중심으로부터의 비드변위에 기초하여 계산될 수 있다. 최근에는 광학 핀셋이 공초점 현미경검사(도 1B)와 결합되어 형광 또는 Förster 공명 에너지 전달(FRET) 측정40,41,42를 가능하게 합니다. 이렇게 하면 동시 측정을 가능하게 하는 완전히 새로운 실험 분야가 열리므로 힘 분광법과 형광 데이터의 정확한 상관 관계가 있습니다.

여기서는, 우리는 번역 프레임 이동을 조절하는 단백질-RNA 상호 작용을 연구하기 위하여 공초점 현미경검사법과 결합된 광학 핀셋을 사용하여 실험을 보여줍니다. 목표와 응축기 사이에 5개의 채널이 있는 플로우 셀은 라미나르 흐름을 통해 연속 적인 샘플 응용을 가능하게 합니다. 미세 유체 채널을 통해 다양한 구성 요소를 직접 주입하여 실습 시간을 줄이면서 실험 전반에 걸쳐 샘플 소비가 거의 되지 않습니다.

첫째, OT 실험의 설계를 지원하는 기본 지침이 제안되고 다양한 설정의 함정뿐만 아니라 장점이 논의됩니다. 다음으로, 샘플 및 실험 워크플로우의 준비가 설명되고, 데이터 분석을 위한 프로토콜이 제공됩니다. 예를 나타내기 위해, 우리는 RNA 스트레칭 실험으로부터 얻은 결과를 설명하고, 다른 판독 프레임으로부터 바이러스 RNA의 번역을 변화시키는 아연 핑거 항바이러스 단백질(ZAP)의 짧은 이소폼을 트랜스-작용 인자로 SARS-CoV-2 프레임 이동 RNA 요소(도 2A)를 연구하는 결과를 설명한다. 또한, 형광 라벨리보솜이 OT 공초점 분석에서 사용될 수 있음을 입증하여 번역 기계의 공정성과 속도를 모니터링하는 데 유용할 것입니다. 여기에 제시된 방법은 번역의 다양한 측면을 연구하기 위해 다른 버퍼, 리간드 또는 기타 세포 구성 요소의 효과를 빠르게 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로 일반적인 실험적 함정과 문제를 해결하는 방법에 대해 논의합니다. 아래, 실험 디자인의 몇 가지 중요한 포인트가 설명되어 있습니다.

구성 설계
원칙적으로 OT 호환 RNA 구조를 만드는 두 가지 일반적인 접근 방식이 있습니다. 첫 번째 접근법은 보완적인 DNA 손잡이로 혼성화되는 긴 RNA 분자를 채택하여 중간에 단일 좌초 RNA 서열을 측면시키는 2개의 RNA/DNA 하이브리드 영역으로 구성된 구조를 산출한다(도 2B). 이 접근법은 대부분의 OT RNA 실험에서 33,44,45에 사용됩니다.

두 번째 접근법은 짧은 (약 20 nt) overhangs15,17로 dsDNA 핸들을 활용합니다. 이 돌출은 RNA 분자로 혼성화됩니다. 디자인에서 더 복잡하더라도, dsDNA 처리의 사용은 DNA/RNA 하이브리드 시스템의 몇몇 한계를 극복합니다. 원칙적으로 매우 긴 핸들(>10kb)을 구현할 수 있어 공초점 측정에 더 편리합니다. 또한, RNA 분자는 테더 안정성을 높이기 위해 DNA 손잡이로 회개될 수 있다.

최종 라벨링 전략
구조는 강력한 분자 상호 작용을 통해 구슬에 묶여 있어야합니다. 구슬46에 손잡이의 공유 결합에 사용할 수있는 접근 방법이 있지만, 스트렙타비딘 – 비오틴 및 디곡시게닌 항체와 같은 강력하지만 비 공유 상호 작용은 OT 실험에서 일반적으로 사용된다15,33,35,45. 설명된 프로토콜에서, 구조는 비오틴 또는 디곡시게닌으로 표지되고, 구슬은 디곡시게닌에 대하여 스트렙타비딘 또는 항체로 각각 코팅된다(도 1A). 이 방법은 최대 약 60 pN(밧줄 당)47까지 힘을 적용하는 데 적합합니다. 더욱이, 다른 5′ 및 3’라벨링 전략을 사용하면 구슬사이에 형성된 밧줄의 방향을 결정할 수 있다17.

형광 측정을 위한 단백질 라벨링
공초점 화상 진찰을 위해, 형광 표지를 위한 몇몇 일반적으로 이용된 접근이 있습니다. 예를 들어, 형광은 단백질에서 기본적으로 발견되거나 반응성 유기 그룹을 통해 현장 지향 돌연변이 발생에 의해 도입되는 아미노산 잔류물에 공유적으로 부착될 수 있다. 티올 또는 아민 반응성 염료는 각각 시스테인 및 리신 잔류물의 라벨링에 사용할 수 있습니다. 라벨링48,49의 특이성을 증가시키는 몇 가지 가역적인 보호 방법이 있지만, 토착 단백질은 일반적으로 여러 잔류물에서 표지될 것입니다. 형광의 작은 크기는 이점을 부여 할 수 있지만, 비 특이적 라벨은 단백질 활성을 방해할 수 있으며 따라서 신호 강도는 다를 수 있습니다49. 또한 라벨링 효율에 따라 신호 강도는 상이한 실험 간에 다를 수 있다. 따라서 실험 전에 활동 검사를 수행해야 합니다.

관심 있는 단백질에 His-tag 또는 스트렙 태그와 같은 N-또는 C 단말 태그가 포함된 경우 이러한 태그의 특정 라벨링은 또 다른 인기 있는 접근 방식을 나타냅니다. 더욱이, 태그 표적 라벨링은 플루오로포어가 단백질 활성을 방해할 가능성을 감소시키고 용해도를 향상시킬 수 있다49. 그러나 태그별 라벨링은 일반적으로 모노 플루오로포어 표지 단백질을 생성하므로 감지하기가 어려울 수 있습니다. 특정 라벨링의 또 다른 방법은 항체를 채택함으로써 달성될 수 있다.

미세 유체 설정
OT와 미세 유체 시스템의 조합은 다른 실험 조건 사이의 빠른 전환을 허용합니다. 더욱이, 현재 시스템은 유동 방향에 비해 수직 방향으로 다른 채널에서 액체의 혼합을 배제하는 유동 셀 내부의 라미나르 흐름을 유지하는 것을 활용한다. 따라서, 라미나르 유량은 실험 설계에 특히 유리하다. 현재 최대 5개의 채널을 사용하는 유동 셀이 일반적으로 사용됩니다(그림 3).

Protocol

1. 샘플 준비 핸들 서열로 작용하는 람다 DNA 단편을 포함하는 벡터내관심서열을 복제한다(도 2)43,50. 먼저 PCR을 통해 후속 체외 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성한다(도 2B; 반응 1). 이 PCR 단계에서, T7 프로모터는 감각 DNA 분자32,33,43,50…

Representative Results

이 섹션에서는, 초점은 주로 형광 광학 핀셋에 의한 RNA 단백질/리간드 상호작용의 측정에 주어집니다. 일반적인 RNA 광학 핀셋 실험 및 해당 대표 결과에 대한 설명을 보려면 see32. RNA/DNA 단백질 상호 작용 에 대한 자세한 논의를 위해 1,26,59,60을 참조하십시오</sup…

Discussion

여기서는 다양한 리간드를 사용한 RNA 분자의 상호 작용과 동적 행동을 연구하기 위해 형광 결합 광학 핀셋의 사용을 입증합니다. 아래에서 현재 기술의 중요한 단계와 한계에 대해 설명합니다.

프로토콜의 중요한 단계
다른 많은 방법에 관해서는, 샘플의 품질은 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해 중추적 인이다. 따라서 가능한 최고 품질의 샘플을 얻으려면 시…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 아누자 키베와 준 교수 레드몬드 Smyth 비판적으로 원고를 검토해 주셔서 감사합니다. 우리는 전문 기술 지원을 위한 Tatyana Koch에게 감사드립니다. 실험적인 비디오 녹화에 도움을 주신 크리스티나 페카르코바에게 감사드립니다. 우리의 실험실에서 작품은 헬름홀츠 협회에 의해 지원되고 유럽 연구 위원회 (ERC) 그랜트 nr. 948636 (NC에)에서 자금.

Materials

Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy
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References

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Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).
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