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Automatic Translation
Biochemistry

Pinças ópticas para estudar interações RNA-proteína no regulamento de tradução

Published: February 12, 2022
doi:
10.3791/62589
, ,
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI),Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty,Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho experimental completo para estudar interações RNA-proteína usando pinças ópticas. Várias possíveis configurações experimentais são delineadas, incluindo a combinação de pinças ópticas com microscopia confocal.

Abstract

O RNA adota diversas dobras estruturais, essenciais para suas funções e, assim, podem impactar diversos processos na célula. Além disso, a estrutura e a função de um RNA podem ser moduladas por vários fatores trans-acionados, como proteínas, metabólitos ou outras RNAs. As moléculas de RNA de mudança de quadro, por exemplo, são RNAs regulatórias localizadas em regiões de codificação, que direcionam ribossomos de tradução em um quadro de leitura aberto alternativo e, assim, agem como interruptores genéticos. Eles também podem adotar diferentes dobras após a ligação a proteínas ou outros fatores trans. Para dissecar o papel das proteínas vinculantes ao RNA na tradução e como elas modulam a estrutura e a estabilidade do RNA, é crucial estudar as características interpulsão e mecânica desses complexos de proteína RNA simultaneamente. Este trabalho ilustra como empregar pinças ópticas acopladas a uma molécula única para explorar a paisagem conformacional e termodinâmica dos complexos de proteína RNA em alta resolução. Como exemplo, elabora-se a interação do elemento ribossômico programado SARS-CoV-2 com o fator trans-ação de isoforme curto da proteína antiviral de dedo de zinco. Além disso, ribossomos rotulados por fluorescência foram monitorados utilizando-se a unidade confocal, o que, em última análise, permitiria o estudo do alongamento da tradução. O ensaio de fluorescência acoplado de OT pode ser amplamente aplicado para explorar diversos complexos de proteína RNA ou fatores trans-atuantes que regulam a tradução e poderia facilitar estudos de regulação genética baseada em RNA.

Introduction

A transferência de informações genéticas do DNA para as proteínas através dos mRNAs é um processo bioquímico complexo, que é precisamente regulado em todos os níveis através de interações macromoleculares dentro das células. Para a regulação translacional, as interações RNA-proteína conferem um papel crítico para reagir rapidamente a vários estímulos e sinais1,2. Algumas interações RNA-proteína afetam a estabilidade do mRNA e, assim, alteram o tempo em que um RNA é tratilicamente ativo. Outras interações RNA-proteína estão associadas a mecanismos de recodificação, como leitura stop-codon, bypass ou mudança de quadro ribossômico programada (PRF)3,4,5,6,7. Recentemente, uma série de proteínas de ligação de RNA (RBPs) foram demonstradas para interagir com elementos estimulantes de mRNA e a máquina de tradução para ditar quando e quanta reco codificação ocorrerá nas células7,8,9,10,11. Assim, dissecar o papel das proteínas vinculantes ao RNA na tradução e como elas modulam a estrutura e a estabilidade do RNA, é fundamental estudar os princípios de interação e propriedades mecânicas desses complexos de proteína RNA em detalhes.

Décadas de trabalho estabeleceram as bases para estudar o processo de tradução multi-passo e multicomponente, que conta com a comunicação intrincada entre o RNA e componentes proteicos da máquina de tradução para alcançar velocidade e precisão12,13,14. Um próximo passo crucial na compreensão de eventos regulatórios complexos é determinar as forças, escalas de tempo e determinantes estruturais durante a tradução em alta precisão12,15,16,17. O estudo da dinâmica conformacional do RNA e especialmente como fatores auxiliares trans-acionam na estrutura do RNA durante a tradução foram ainda mais iluminados pelo surgimento de ferramentas de molécula única, incluindo pinças ópticas ou guias de ondas de modo zero16,17,18,19,20,21,22,23,24 25,26.

A pinça óptica (OT) representa uma técnica de molécula única altamente precisa, que tem sido aplicada para estudar muitos tipos de processos dinâmicos dependentes de RNA, incluindo transcrição, e tradução26,27,28,29,30,31,32. O uso de pinças ópticas permitiu a sondagem de interações moleculares, estruturas de ácido nucleico e propriedades termodinâmicas, cinéticas e energéticas desses processos em detalhes16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . O ensaio óptico da pinça é baseado na armadilha de objetos microscópicos com um raio laser focado. Em um experimento típico de OT, a molécula de interesse é amarrada entre duas contas transparentes (geralmente poliestireno) (Figura 1A)27. Essas contas são então capturadas por armadilhas ópticas, que se comportam como molas. Assim, a força aplicada na molécula pode ser calculada com base no deslocamento da conta do centro do raio laser focal focado (centro da armadilha). Recentemente, pinças ópticas foram combinadas com microscopia confocal (Figura 1B), permitindo medidas de fluorescência ou transferência de energia de ressonância Förster (FRET)40,41,42. Isso abre um novo campo de possíveis experimentos permitindo medição simultânea e, portanto, correlação precisa de dados de espectroscopia de força e fluorescência.

Aqui, demonstramos experimentos usando as pinças ópticas combinadas com microscopia confocal para estudar interações proteína-RNA regulando a mudança de quadro translacional. Entre o objetivo e o condensador, uma célula de fluxo com cinco canais permite a aplicação contínua da amostra com fluxo laminar. Através dos canais microfluidos, vários componentes podem ser injetados diretamente, o que diminui o tempo prático, além de permitir muito pouco consumo amostral ao longo do experimento.

Em primeiro lugar, uma diretriz básica para auxiliar o desenho de experimentos OT é proposta e vantagens, bem como armadilhas de várias configurações são discutidas. Em seguida, são descritas amostras e fluxos de trabalho experimentais e um protocolo para a análise dos dados. Para representar um exemplo, descrevemos os resultados obtidos a partir de experimentos de alongamento de RNA para estudar o elemento RNA de mudança de quadro SARS-CoV-2 (Figura 2A) com o fator trans-ação o isoforme curto da proteína antiviral de dedo de zinco (ZAP), que altera a tradução do RNA viral de um quadro de leitura alternativo43. Além disso, demonstra-se que ribossósicos rotulados por fluorescência podem ser empregados neste ensaio confocal OT, o que seria útil para monitorar a processividade e a velocidade da máquina de tradução. O método aqui apresentado pode ser usado para testar rapidamente o efeito de diferentes buffers, ligantes ou outros componentes celulares para estudar vários aspectos da tradução. Finalmente, são discutidas armadilhas experimentais comuns e como solucioná-las. Abaixo, alguns pontos cruciais no design experimental são delineados.

Projeto de construção
Em princípio, existem duas abordagens comuns para criar um RNA compatível com OT. A primeira abordagem emprega uma molécula de RNA longa que é hibridizada com alças de DNA complementares, produzindo assim um construto composto por duas regiões híbridas de RNA/DNA flanqueando uma sequência de RNA de uma única linha no meio (Figura 2B). Essa abordagem é empregada na maioria dos experimentos de RNA OT33,44,45.

A segunda abordagem aproveita as alças dsDNA com saliências curtas (em torno de 20 nt) 15,17. Essas saliências são então hibridizadas com a molécula de RNA. Embora mais complicado no design, o uso de alças dsDNA supera algumas das limitações do sistema DNA/RNA-híbrido. Em princípio, mesmo alças muito longas (>10kb) podem ser implementadas, o que é mais conveniente para medições confocal. Além disso, a molécula de RNA pode ser ligada às alças de DNA para aumentar a estabilidade das amarras.

Estratégia de rotulagem final
A construção deve ser amarrada a contas através de uma forte interação molecular. Embora existam abordagens disponíveis para a ligação covalente de alças a contas46, interações fortes, mas não covalentes, como streptavidin-biotina e digoxigenina-anticorpo são comumente usadas em experimentos OT15,33,35,45. No protocolo descrito, a construção é rotulada com biotina ou digoxigenina, e as contas são revestidas com streptavidina ou anticorpos contra digoxigenina, respectivamente (Figura 1A). Esta abordagem seria adequada para a aplicação de forças de até aproximadamente 60 pN (por tether)47. Além disso, o uso de diferentes estratégias de rotulagem de 5′ e 3′ permitem determinar a orientação da corda formada entre as contas17.

Rotulagem de proteínas para medidas de fluorescência
Para a imagem confocal, existem várias abordagens comumente utilizadas para rotulagem de fluorescência. Por exemplo, fluoroforos podem ser covalentemente ligados a resíduos de aminoácidos que são encontrados nativamente em proteínas ou introduzidos por mutagênese direcionada ao local através de um grupo orgânico reativo. Corantes de tiol ou amina-reativa podem ser usados para rotulagem de resíduos de cisteína e liseina, respectivamente. Existem vários métodos de proteção reversíveis para aumentar a especificidade da rotulagem48,49, porém as proteínas nativas normalmente seriam rotuladas em múltiplos resíduos. Embora o pequeno tamanho do fluorohore possa conferir uma vantagem, a rotulagem não específica pode interferir na atividade proteica e, portanto, a intensidade do sinal pode variar49. Além disso, dependendo da intensidade do sinal de eficiência de rotulagem pode diferir entre diferentes experimentos. Portanto, uma verificação de atividade deve ser realizada antes do experimento.

Caso a proteína de interesse contenha uma tag terminal N ou C, como uma tag His ou marca de estreptococos, a rotulagem específica dessas tags representa outra abordagem popular. Além disso, a rotulagem direcionada a tags reduz a chance do fluorohore interferir na atividade proteica e pode aumentar a solubilidade49. No entanto, a rotulagem específica de etiquetas geralmente produz proteínas rotuladas mono-fluorforo, o que pode ser desafiador de detectar. Outra forma de rotulagem específica pode ser realizada empregando anticorpos.

Configuração de microfluidos
A combinação de OT com um sistema de microfluidos permite uma transição rápida entre diferentes condições experimentais. Além disso, os sistemas atuais aproveitam a manutenção do fluxo laminar dentro da célula de fluxo, o que impede a mistura de líquidos de outros canais na direção perpendicular em relação à direção de fluxo. Portanto, o fluxo laminar é particularmente vantajoso para o design experimental. Atualmente, células de fluxo com até 5 canais são comumente empregadas (Figura 3).

Protocol

1. Preparação da amostra Clone a sequência de interesse no vetor contendo os fragmentos de DNA lambda, que servem como sequências de alça (Figura 2)43,50. Primeiro gerar um modelo de DNA para transcrição in vitro subsequente via PCR (Figura 2B; reação 1). Nesta etapa do PCR, o promotor T7 é adicionado no final de 5′ da molécula de DNA de sentido32,…

Representative Results

Nesta seção, o foco é dado principalmente em medidas de interações RNA-proteína/ligand pelas pinças ópticas fluorescência. Para uma descrição dos experimentos gerais de pinça óptica RNA e resultados representativos correspondentes, consulte32. Para uma discussão mais detalhada das interações RNA/DNA-proteína, consulte também 1,2,26,59,60.<sup…

Discussion

Aqui, demonstramos o uso de pinças ópticas acopladas à fluorescência para estudar interações e comportamento dinâmico de moléculas de RNA com vários ligantes. Abaixo, são discutidas etapas críticas e limitações da presente técnica.

Passos críticos no protocolo
Como para muitos outros métodos, a qualidade da amostra é fundamental para obter dados confiáveis. Portanto, para obter as amostras de maior qualidade possível, vale a pena gastar tempo para otimiza…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Anuja Kibe e ao Prof. Redmond Smyth por revisarem criticamente o manuscrito. Agradecemos a Tatyana Koch pela assistência técnica especializada. Agradecemos a Kristyna Pekarkova pela ajuda na gravação de vídeos experimentais. O trabalho em nosso laboratório é apoiado pela Associação Helmholtz e financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) Grant Nr. 948636 (para a NC).

Materials

Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy
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Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).
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