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Biochemistry

翻訳調節におけるRNA-タンパク質相互作用を研究する光ピンセット

Published: February 12, 2022
doi:
10.3791/62589
, ,
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI),Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty,Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

このプロトコルは、光ピンセットを用いたRNAとタンパク質の相互作用を研究するための完全な実験的ワークフローを提示する。光ピンセットと共焦点顕微鏡の組み合わせを含むいくつかの可能な実験セットアップが概説されている。

Abstract

RNAは、その機能に不可欠な多様な構造フォールドを採用しており、細胞内の多様なプロセスに影響を与える可能性があります。また、RNAの構造と機能は、タンパク質、代謝物、または他のRNAなどの様々な トランス作用因子によって変調することができます。例えば、フレームシフトRNA分子は、リボソームを別のオープンリーディングフレームに直接翻訳し、遺伝子スイッチとして機能するコード領域に位置する調節RNAです。彼らはまた、タンパク質または他の トランスファクターに結合した後に異なる折り目を採用することができます。翻訳におけるRNA結合タンパク質の役割と、RNAの構造と安定性を調節する方法を解剖するには、これらのRNA-タンパク質複合体の相互作用と機械的特徴を同時に研究することが重要です。この研究は、単分子蛍光結合光ピンセットを採用して、RNA-タンパク質複合体の立体構造および熱力学的景観を高解像度で探索する方法を示しています。一例として、SARS-CoV-2プログラムリボソームフレームシフトエレメントと、ジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質の 経作用因子短いアイソフォームとの相互作用が詳述される。さらに、蛍光標識リボソームを共焦点単位でモニタリングし、最終的に翻訳伸びの研究を可能にした。蛍光結合OTアッセイは、多様なRNAタンパク質複合体または翻訳を調節する トランス作用因子を探索するために広く適用することができ、RNAベースの遺伝子調節の研究を容易にする可能性があります。

Introduction

mRNAを介したDNAからタンパク質への遺伝情報の伝達は、細胞内の高分子相互作用を通じてあらゆるレベルで正確に調節される複雑な生化学的プロセスです。翻訳調節では、RNAとタンパク質の相互作用は、様々な刺激およびシグナルに迅速に反応する重要な役割を与える1,2。RNAとタンパク質の相互作用の中には、mRNAの安定性に影響を与え、RNAが翻訳的に活性である時間を変化させるものがあります。他のRNA-タンパク質相互作用は、ストップコドンの読み取り、バイパス、またはプログラムリボソームフレームシフト(PRF)3,4,5,6,7などの再コードメカニズムに関連しています。最近では、多くのRNA結合タンパク質(RRP)が、細胞内でいつ、どのくらいのリコードが起こるかを決定するために、刺激性mRNA要素および翻訳機械と相互作用することが実証されています7,8,9,10,11。したがって、翻訳におけるRNA結合タンパク質の役割と、RNA構造および安定性を調節する方法を解剖するためには、RNA-タンパク質複合体の相互作用原理と機械的特性を詳細に研究することが極めて重要です。

数十年にわたる作業は、速度と精度を達成するために翻訳機械のRNAとタンパク質成分の間の複雑なコミュニケーションに依存する翻訳のマルチステップおよびマルチコンポーネントプロセスを研究するための基礎を築いてきました12,13,14。複雑な規制事象を理解するうえで重要な次のステップは、翻訳中の力、タイムスケール、構造決定要因を高精度で決定することです12,15,16,17。RNAの立体構造ダイナミクス、特に翻訳中のRNA構造に対するトランス作用補助因子の作用の研究は、光ピンセットやゼロモードの導波ガイドを含む単分子ツールの出現によってさらに明るやかされています16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

光ピンセット(OT)は、転写を含む多くの種類のRNA依存性動的プロセスを研究するために適用された非常に正確な単分子技術を表し、翻訳26,28,28,29,30,31,32。光ピンセットの使用により、分子相互作用、核酸構造、熱力学的特性、運動論、およびこれらのプロセスのエネルギーの詳細な調査が可能になりました17,22,33,34,35,36,37,38,39 .光ピンセットアッセイは、焦点を合わせるレーザービームを有する微視的な物体の封じ込めに基づいている。典型的なOT実験では、目的の分子は2つの透明(通常はポリスチレン)ビーズ(図1A)27の間につながれである。これらのビーズは、その後、スプリングのように動作する光学トラップによってキャッチされます。したがって、分子に適用される力は、焦点を合わせるレーザー光(トラップ中心)の中心からのビードの変位に基づいて計算することができる。近年、光ピンセットを共焦点顕微鏡(図1B)と組み合わせて、蛍光またはフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)測定40,41,42を可能にしました。これにより、同時測定が可能な実験の全く新しい分野が開き、力分光法と蛍光データの正確な相関が可能になります。

ここでは、光ピンセットと共焦点顕微鏡を組み合わせて、並進フレームシフトを調節するタンパク質とRNAの相互作用を研究する実験を行う。目的と凝縮器の間に、5つのチャネルを持つフローセルは、層流を用いた連続的なサンプル塗布を可能にする。マイクロ流体チャネルを介して、様々な成分を直接注入することができ、実験全体を通してサンプル消費をほとんど行わず、実践的な時間を短縮します。

まず、OT実験の設計を支援する基本的なガイドラインを提案し、様々なセットアップの落とし穴と同様に利点を議論する。次に、サンプルの調製と実験ワークフローについて説明し、データ分析のためのプロトコルを提供する。例を示すために、代替読み取りフレーム43からのウイルスRNAの翻訳を変化させるジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質(ZAP)のトランス作用因子を用いてSARS-CoV-2フレームシフトRNA元素(図2A)を研究するRNAストレッチ実験から得られた結果を概説する。さらに、このOT共焦点アッセイでは蛍光標識リボソームを採用できることが実証されており、翻訳機械の加工性と速度を監視するのに役立ちます。ここで提示される方法は、翻訳のさまざまな側面を研究するために、異なるバッファー、リガンド、または他の細胞成分の効果を迅速にテストするために使用することができます。最後に、一般的な実験的な落とし穴と、それらのトラブルシューティング方法について説明します。以下に、実験計画の重要なポイントを概説します。

設計の構築
原則として、OT適合性RNA構築物を作成するための2つの一般的なアプローチがあります。最初のアプローチは、相補的なDNAハンドルとハイブリダイズされる長いRNA分子を採用し、したがって、真ん中に一本鎖RNA配列を横切る2つのRNA/DNAハイブリッド領域からなる構築物を生み出す(図2B)。このアプローチは、ほとんどのOT RNA実験で33,44,45に採用されています。

2 番目のアプローチでは、dsDNA ハンドルの短い (約 20 nt) のオーバーハング数 15,17 を利用します。これらのオーバーハングは、RNA分子とハイブリダイズされます。設計は複雑ですが、dsDNAハンドルを使用すると、DNA/RNAハイブリッドシステムの制限を克服できます。原則として、非常に長いハンドル(>10kb)でも実装できるため、共焦点測定に便利です。さらに、RNA分子をDNAハンドルに連結してテザー安定性を高めることができる。

エンドラベリング戦略
構築物は強い分子相互作用によってビーズにつながれなければならない。ハンドルの共有結合にはbeads46へのアプローチがありますが、ストレプトアビジン-ビオチンおよびジゴキシゲニン抗体などの強いが非共有的な相互作用は、OT実験15,33,35,45で一般的に使用されています。記載されたプロトコルにおいて、構築物はビオチンまたはジゴキシゲニンで標識され、ビーズは、それぞれ、ジゴキシゲニンに対するストレプトアビジンまたは抗体でコーティングされる(図1A)。このアプローチは、最大約60pN(テザー当たり)47の力を加えるのに適しています。さらに、異なる5’および3’ラベル付け戦略を使用することで、ビーズ17の間に形成されるテザーの方向を決定することができる。

蛍光測定用タンパク質標識
共焦点イメージングでは、蛍光標識にはいくつかの一般的に使用されるアプローチがあります。例えば、フルオロフォアは、タンパク質に自在に見られるアミノ酸残基に共有結合したり、反応性有機基を介して部位特異的突然変異誘発によって導入されたりする。チオールまたはアミン反応性染料は、システイン残基およびリジン残基の標識にそれぞれ使用できる。標識48,49の特異性を高めるための可逆的な保護方法はいくつかありますが、ネイティブタンパク質は通常、複数の残基で標識されます。蛍光素の小さなサイズは利点を与えるかもしれませんが、非特異的標識はタンパク質活性を妨げる可能性があり、したがってシグナル強度は49変わることがあります。また、標識効率に応じて信号強度が異なる実験によって異なる場合がある。したがって、実験の前にアクティビティチェックを実行する必要があります。

目的のタンパク質に His タグやストレップ タグなどの N または C 端子タグが含まれている場合、これらのタグの特定の標識は別の一般的なアプローチを表します。さらに、タグ標的標識は、フルオロフォアがタンパク質活性を妨害する可能性を低減し、溶解度49を高めることができる。しかし、タグ特異的標識は通常、モノフルオロフォア標識タンパク質を生み出し、検出が困難である可能性があります。特異的標識の別の方法は、抗体を採用することによって達成することができる。

マイクロ流体セットアップ
OTとマイクロ流体システムの組み合わせにより、異なる実験条件間の迅速な移行が可能になります。さらに、現在のシステムはフローセル内の層流を維持することを利用し、流れ方向に対して垂直方向の他のチャネルからの液体の混合を妨げる。そのため、層流は実験計画に特に有利である。現在、最大5チャンネルのフローセルが一般的に使用されています(図3)。

Protocol

1. サンプル準備 対象の配列を、ハンドル配列として機能するラムダDNAフラグメントを含むベクターにクローン化します(図2)43,50。 まず、PCRを介して後続 のインビトロ 転写用のDNAテンプレートを生成する(図2B;反応1)。このPCRステップでは、T7プロモーターがセンスDNA分?…

Representative Results

このセクションでは、主に蛍光光ピンセットによるRNA-タンパク質/リガンド相互作用の測定に焦点を当てています。一般的なRNA光学ピンセット実験および対応する代表的な結果の説明については、32を参照してください。RNA/DNA-タンパク質相互作用の詳細については、1,26,59,60も参照してくださ?…

Discussion

ここでは、蛍光結合型光ピンセットを用いて、RNA分子と様々なリガンドの相互作用と動的挙動を研究する方法を示す。以下に、本技術の重要なステップと限界について説明します。

プロトコルの重要なステップ
他の多くの方法と同様に、サンプルの品質は信頼性の高いデータを得るために極めて重要です。したがって、可能な限り最高の品質のサンプル?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

原稿を批判的に見直してくれたアヌジャ・キベ教授とレドモンド・スミス教授に感謝します。私たちは、専門家の技術支援のためにタチアナ・コッホに感謝します。私たちは、実験的なビデオを記録する助けのためにクリスティナペカルコワに感謝します.当研究室での研究は、ヘルムホルツ協会と欧州研究評議会(ERC)グラント・Nr・948636(NC)からの資金提供によって支援されています。

Materials

Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy
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Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).
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