JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Optiske pinsett for å studere RNA-proteininteraksjoner i oversettelsesregulering

Published: February 12, 2022
doi:
10.3791/62589
, ,
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI),Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty,Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

Denne protokollen presenterer en komplett eksperimentell arbeidsflyt for å studere RNA-proteininteraksjoner ved hjelp av optisk pinsett. Flere mulige eksperimentelle oppsett er skissert, inkludert kombinasjonen av optisk pinsett med konfikal mikroskopi.

Abstract

RNA vedtar forskjellige strukturelle folder, som er avgjørende for sine funksjoner og dermed kan påvirke ulike prosesser i cellen. I tillegg kan strukturen og funksjonen til en RNA moduleres av ulike transvirkende faktorer, for eksempel proteiner, metabolitter eller andre RNAer. Frameshifting RNA molekyler, for eksempel, er regulatoriske RNAer plassert i koding regioner, som direkte oversette ribosomer til en alternativ åpen leseramme, og dermed fungere som genbrytere. De kan også vedta forskjellige folder etter binding til proteiner eller andre transfaktorer. For å dissekere rollen som RNA-bindende proteiner i oversettelse og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det avgjørende å studere samspillet og mekaniske egenskapene til disse RNA-proteinkompleksene samtidig. Dette arbeidet illustrerer hvordan man bruker enkeltmolekyl-fluorescens-koblede optiske pinsett for å utforske konformasjons- og termodynamisk landskap av RNA-proteinkomplekser med høy oppløsning. Som et eksempel utarbeides samspillet mellom SARS-CoV-2 programmert ribosomal frameshifting element med transvirkende faktor kort isoform av sinkfinger antiviralt protein. I tillegg ble fluorescensmerkede ribosomer overvåket ved hjelp av den konfekale enheten, noe som til slutt ville muliggjøre studiet av oversettelsesforlengelse. Fluorescens koblet OT-analyse kan brukes mye for å utforske forskjellige RNA-proteinkomplekser eller transvirkende faktorer som regulerer oversettelsen og kan lette studier av RNA-basert genregulering.

Introduction

Overføring av genetisk informasjon fra DNA til proteiner gjennom mRNAer er en kompleks biokjemisk prosess, som er nøyaktig regulert på alle nivåer gjennom makromolekylære interaksjoner inne i celler. For translasjonsregulering gir RNA-proteininteraksjoner en kritisk rolle for raskt å reagere på ulike stimuli og signaler1,2. Noen RNA-proteininteraksjoner påvirker mRNA-stabiliteten og endrer dermed tiden en RNA er translasjonelt aktiv. Andre RNA-protein interaksjoner er forbundet med omkodingsmekanismer som stop-codon readthrough, bypassing eller programmert ribosomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Nylig har en rekke RNA-bindende proteiner (RBPer) vist seg å samhandle med stimulatoriske mRNA-elementer og oversettelsesmaskineriet for å diktere når og hvor mye omkoding som vil forekomme i cellen7,8,9,10,11. For å dissekere rollen som RNA-bindende proteiner i oversettelse og hvordan de modulerer RNA-struktur og stabilitet, er det derfor avgjørende å studere interaksjonsprinsippene og mekaniske egenskapene til disse RNA-proteinkompleksene i detalj.

Tiår med arbeid har lagt grunnlaget for å studere flertrinns- og flerkomponentprosessen for oversettelse, som er avhengig av intrikat kommunikasjon mellom RNA og proteinkomponentene i oversettelsesmaskineriet for å oppnå hastighet og nøyaktighet12,13,14. Et avgjørende neste skritt for å forstå komplekse regulatoriske hendelser er å bestemme krefter, tidsskalaer og strukturelle determinanter under oversettelse med høy presisjon12,15,16,17. Studien av RNA-konformasjonsdynamikk og spesielt hvordan transvirkende hjelpefaktorer virker på RNA-strukturen under oversettelse har blitt ytterligere opplyst av fremveksten av enkeltmolekylverktøy, inkludert optiske pinsett eller nullmodusbølgeledere16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Optisk pinsett (OT) representerer en svært presis enkeltmolekylteknikk, som har blitt brukt til å studere mange slags RNA-avhengige dynamiske prosesser, inkludert transkripsjon, og oversettelse26,27,28,29,30,31,32. Bruken av optiske pinsett har gjort det mulig å undersøke molekylære interaksjoner, nukleinsyrestrukturer og termodynamiske egenskaper, kinetikk og energi av disse prosessene i detalj16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optisk pinsettanalyse er basert på entrapment av mikroskopiske objekter med en fokusert laserstråle. I et typisk OT-eksperiment er interessemolekylet bundet mellom to gjennomsiktige (vanligvis polystyren) perler (figur 1A)27. Disse perlene blir deretter fanget av optiske feller, som oppfører seg som fjærer. Dermed kan kraften som påføres molekylet beregnes basert på perlens forskyvning fra midten av den fokuserte laserstrålen (fellesenteret). Nylig har optisk pinsett blitt kombinert med konfektmikroskopi (figur 1B), noe som muliggjør fluorescens eller Förster resonansenergioverføring (FRET) målinger40,41,42. Dette åpner et helt nytt felt av mulige eksperimenter som tillater samtidig måling og derfor presis korrelasjon av kraftspektroskopi- og fluorescensdata.

Her demonstrerer vi eksperimenter ved hjelp av de optiske pinsettene kombinert med konfikal mikroskopi for å studere protein-RNA-interaksjoner som regulerer translasjonell frameshifting. Mellom målsettingen og kondensatoren muliggjør en strømningscelle med fem kanaler kontinuerlig prøveapplikasjon med laminær strømning. Gjennom mikrofluidiske kanaler kan ulike komponenter injiseres direkte, noe som reduserer den praktiske tiden, samt tillater svært lite prøveforbruk gjennom hele eksperimentet.

For det første foreslås en grunnleggende retningslinje for å bistå utformingen av OT-eksperimenter, og fordeler samt fallgruver i ulike oppsett diskuteres. Deretter beskrives utarbeidelsen av prøver og eksperimentelle arbeidsflyter, og en protokoll for dataanalysen er gitt. For å representere et eksempel skisserer vi resultatene fra RNA-strekkeksperimenter for å studere SARS-CoV-2 frameshifting RNA-elementet (figur 2A) med transvirkende faktor den korte isoformen av sinkfinger antiviralt protein (ZAP), som endrer oversettelsen av viral RNA fra en alternativ leseramme43. I tillegg er det demonstrert at fluorescensmerkede ribosomer kan brukes i denne OT-konfiskeringsanalysen, noe som vil være nyttig for å overvåke prosessiviteten og hastigheten til oversettelsesmaskineriet. Metoden som presenteres her, kan brukes til raskt å teste effekten av forskjellige buffere, ligander eller andre cellulære komponenter for å studere ulike aspekter ved oversettelse. Til slutt diskuteres vanlige eksperimentelle fallgruver og hvordan du feilsøker dem. Nedenfor er noen viktige punkter i eksperimentell design skissert.

Konstruere design
I prinsippet er det to vanlige tilnærminger for å skape en OT-kompatibel RNA-konstruksjon. Den første tilnærmingen bruker et langt RNA-molekyl som er hybridisert med komplementære DNA-håndtak, og gir dermed en konstruksjon som består av to RNA / DNA-hybridregioner som flankerer en enkeltstrenget RNA-sekvens i midten (figur 2B). Denne tilnærmingen brukes i de fleste OT RNA-eksperimenter33,44,45.

Den andre tilnærmingen utnytter dsDNA-håndtak med korte (rundt 20 nt) overheng15,17. Disse overhengene blir deretter hybridisert med RNA-molekylet. Selv om det er mer komplisert i design, overvinner bruken av dsDNA-håndtak noen av begrensningene i DNA / RNA-hybridsystemet. I prinsippet kan selv svært lange håndtak (>10kb) implementeres, noe som er mer praktisk for konfiskeringer. I tillegg kan RNA-molekylet ligateres til DNA-håndtak for å øke tetherstabiliteten.

Strategi for sluttmerking
Konstruksjonen må knyttes til perler via en sterk molekylær interaksjon. Mens det er tilnærminger tilgjengelig for kovalent binding av håndtak til perler46, brukes sterke, men ikke-kovalente interaksjoner som streptavidin-biotin og digoxigenin-antistoff ofte i OT-eksperimenter15,33,35,45. I den beskrevne protokollen er konstruksjonen merket med biotin eller digoksigenin, og perlene er belagt med streptavidin eller antistoffer mot henholdsvis digoxigenin (figur 1A). Denne tilnærmingen vil være egnet for påføring av krefter opp til ca. 60 pN (per tether)47. Videre tillater bruken av forskjellige 5′ og 3 ‘ merkingsstrategier å bestemme orienteringen av tether dannet mellom perlene17.

Proteinmerking for fluorescensmålinger
For den kondokale avbildningen er det flere ofte brukte tilnærminger for fluorescensmerking. For eksempel kan fluoroforer festes kovalent til aminosyrerester som finnes innfødt i proteiner eller introdusert av stedsstyrt mutagenese gjennom en reaktiv organisk gruppe. Tiol- eller aminreaktive fargestoffer kan brukes til merking av henholdsvis cystein- og lysinrester. Det finnes flere reversible beskyttelsesmetoder for å øke spesifisiteten til merkingen av48,49, men innfødte proteiner vil vanligvis bli merket ved flere rester. Selv om den lille størrelsen på fluoroforen kan gi en fordel, kan ikke-spesifikk merking forstyrre proteinaktiviteten og dermed kan signalintensiteten variere49. Avhengig av etiketteffektivitetssignalintensiteten kan det også variere mellom forskjellige eksperimenter. Derfor bør en aktivitetskontroll utføres før eksperimentet.

I tilfelle proteinet av interesse inneholder en N- eller C-terminal tag, for eksempel en His-tag eller strep-tag, representerer spesifikk merking av disse taggene en annen populær tilnærming. Videre reduserer tag-målrettet merking sjansen for at fluoroforen forstyrrer proteinaktiviteten og kan forbedre løseligheten49. Tag-spesifikk merking gir imidlertid vanligvis mono-fluoroformerkede proteiner, noe som kan være utfordrende å oppdage. En annen måte å spesifikk merking kan oppnås ved å bruke antistoffer.

Oppsett av mikrofluidikk
Kombinasjonen av OT med et mikrofluidikksystem muliggjør en rask overgang mellom ulike eksperimentelle forhold. Videre utnytter nåværende systemer å opprettholde laminærstrømmen inne i strømningscellen, noe som utelukker blanding av væsker fra andre kanaler i vinkelrett retning i forhold til strømningsretningen. Derfor er laminær strømning spesielt fordelaktig for eksperimentell design. For tiden brukes flytceller med opptil 5 kanaler ofte (figur 3).

Protocol

1. Prøvepreparering Klone sekvensen av interesse inn i vektoren som inneholder Lambda DNA fragmenter, som tjener som håndtak sekvenser (Figur 2)43,50. Generer først en DNA-mal for påfølgende in vitro-transkripsjon via PCR (figur 2B, reaksjon 1). På dette PCR-trinnet blir T7-promotoren lagt til i 5′ enden av sansen DNA-molekyl32,33,43,50.<sup class="xref…

Representative Results

I denne delen fokuseres det hovedsakelig på målinger av RNA-protein/ligand interaksjoner av fluorescens optisk pinsett. For en beskrivelse av generelle RNA optisk pinsett eksperimenter og tilsvarende representative resultater, se32. For mer detaljert diskusjon av RNA/DNA-proteininteraksjonene, se også1,2,26,59,60. <p class="jove_…

Discussion

Her demonstrerer vi bruken av fluorescens-koblede optiske pinsett for å studere interaksjoner og dynamisk oppførsel av RNA-molekyler med ulike ligander. Nedenfor diskuteres kritiske trinn og begrensninger i den nåværende teknikken.

Kritiske trinn i protokollen
Når det gjelder mange andre metoder, er kvaliteten på prøven avgjørende for å oppnå pålitelige data. Derfor, for å oppnå høyest mulig kvalitetsprøver, er det verdt det å bruke tid på å optimalisere p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Anuja Kibe og jun. prof. Redmond Smyth for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Vi takker Tatyana Koch for ekspert teknisk assistanse. Vi takker Kristyna Pekarkova for hjelpen med å spille inn eksperimentelle videoer. Arbeidet i vårt laboratorium støttes av Helmholtz-foreningen og midler fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) Grant Nr. 948636 (til NC).

Materials

Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096 (2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172 (2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582 (2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler’s murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406 (2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O’Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714 (2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799 (2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O’Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23 (2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542 (2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500 (2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549 (2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484 (2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193 (2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137 (2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795 (1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166 (2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110 (2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246 (2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272 (2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749 (2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Tags

Optical TweezersRNA-protein InteractionsTranslation RegulationSingle Molecule TechniquesFluorescence Assisted Optical TweezersForce-ramp ExperimentsConstant Force MeasurementsReal-time VisualizationDNA-RNA ConstructIn-vitro TranscriptionPCR Reactions
check_url/62589?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image