Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

Summary

Presentiamo un metodo per studiare l’organizzazione spaziale dei condrociti nell’anulus fibrosus del disco intervertebrale utilizzando un metodo di sezionamento ottico.

Abstract

La degenerazione del disco intervertebrale (IVD) è una delle principali cause di lombalgia e comporta un alto grado di compromissione per gli individui colpiti. Per decodificare la degenerazione del disco e per essere in grado di sviluppare approcci rigenerativi è essenziale una conoscenza approfondita della biologia cellulare dell’IVD. Un aspetto di questa biologia che rimane ancora senza risposta è la domanda su come le cellule sono disposte spazialmente in uno stato fisiologico e durante la degenerazione. Le proprietà biologiche dell’IVD e la sua disponibilità rendono questo tessuto difficile da analizzare. Il presente studio indaga l’organizzazione spaziale dei condrociti nell’anulus fibroso dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione allo stadio terminale. Un metodo di sezionamento ottico (Apotome) viene applicato per eseguire analisi di colorazione ad alta risoluzione utilizzando tessuto embrionale bovino come modello animale e tessuto del disco umano ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale. Da una densità di condrociti molto elevata nel disco bovino embrionale precoce, il numero di cellule diminuisce durante la gestazione, la crescita e la maturazione. Nei dischi umani, un aumento della densità cellulare ha accompagnato la progressione della degenerazione tissutale. Come era già stato dimostrato nella cartilagine articolare, la formazione di cluster rappresenta una caratteristica della degenerazione avanzata del disco.

Introduction

Il disco intervertebrale (IVD) è una struttura a base di cartilagine che biochimicamente e rispetto all’architettura cellulare, a prima vista, assomiglia per molti versi alla cartilagine^{articolare 1.} Infatti, sia la degenerazione IVD che l’osteoartrite (OA) della cartilagine articolare sono caratterizzate da restringimento dello spazio articolare a causa dell’usura della cartilagine, della cisti subcondrale e della formazione di osteofiti e della sclerosi subcondrale^2,3. Nonostante queste apparenti somiglianze, l’architettura e il ruolo funzionale di entrambi i tessuti differiscono. Mentre la matrice della cartilagine articolare è formata principalmente da una rete di collagene di tipo II che forma arcade, l’IVD è costituito da tre diversi tipi di tessuto: il nucleo polposo ricco di collagene di tipo II al centro assorbe carichi assiali e li trasmette a un anello comprensivo di fibre circolari di collagene di tipo I densamente imballate che è chiamato anulus fibrosus. La loro funzione è quella di assorbire le pressioni assiali tradotte ricevute dal nucleo ricco di proteoglicani e acqua con la loro resistenza longitudinale a trazione delle fibre. Nella parte superiore e inferiore di ciascun nucleo e anulus una piastra terminale cartilaginea ialina forma la giunzione alle vertebre adiacenti⁴ (Figura 1).

Nella cartilagine articolare si possono trovare quattro distinti modelli spaziali di condrociti: coppie, stringhe, doppie corde, piccoli gruppi rispettivamente grandi^5,6,7 (Figura 2). I cambiamenti in questo modello sono associati all’insorgenza e alla progressione dell’OA^8,9. L’organizzazione spaziale dei condrociti è anche indicativa di una proprietà funzionale diretta della cartilagine, vale a dire la sua rigidità, sottolineando la rilevanza funzionale di questo approccio di classificazione basato su immagini^10,11. Questi modelli possono inoltre essere identificati con la tecnologia clinicamente disponibile già esistente¹². A causa delle somiglianze tra l’IVD e la cartilagine articolare, si può ipotizzare che nell’IVD siano presenti anche modelli caratteristici di condrociti. La formazione di cluster è un fenomeno osservato anche nella IVD^{degenerata 13,14.}

Quando si tenta di analizzare l’organizzazione cellulare spaziale nell’IVD, è necessario superare diverse difficoltà tecniche che non sono presenti quando si studia la cartilagine articolare:

In primo luogo, l’elaborazione del tessuto stesso è molto più impegnativa rispetto alla cartilagine ialina omogenea che è in gran parte composta da collagene di tipo II. Il principale componente della fibra dell’IVD è il collagene di tipo I, il che rende molto più difficile generare sezioni istologiche sottili. Mentre nella cartilagine articolare ialina anche le sezioni spesse possono essere facilmente analizzate a causa della natura “vetrosa” del tessuto, la rete di collagene di tipo I dell’IVD è otticamente altamente impenetrabile. Per questo motivo, un forte rumore di fondo è un problema comune nell’istologia dell’IVD. Un modo rapido ed economico per penetrare questo tessuto otticamente denso è l’uso di un dispositivo di sezionamento ottico, ad esempio per mezzo di un apotome. In un tale Apotome, una griglia viene inserita nel percorso di illuminazione di un microscopio a fluorescenza convenzionale. Di fronte alla griglia è posizionata una lastra di vetro parallela al piano. Questo si inclina avanti e indietro proiettando così la griglia nell’immagine in tre diverse posizioni. Per ogni posizione z, vengono create e sovrapposte tre immagini raw con la griglia proiettata. Tramite un software speciale, è possibile calcolare la luce fuori fuoco. Il principio di base è che, se la griglia è visibile, quell’informazione è a fuoco, se non è considerata sfocata. Con questa tecnica, immagini ben focalizzate e ad alta risoluzione possono essere acquisite in un ragionevole lasso di tempo.

In secondo luogo, il tessuto è difficile da reperire da donatori umani. Quando si esegue la sostituzione totale del ginocchio, è possibile ottenere l’intera superficie dell’articolazione per ulteriori analisi durante l’intervento chirurgico. Sebbene l’artrosi di un’articolazione diartrodiale sia anche una malattia dell’intera articolazione, ci sono tuttavia forti differenze focali nella qualità della cartilagine con di solito alcune aree dell’articolazione ancora intatte, ad esempio a causa del carico ridotto in quell’area. Questa situazione è diversa nell’IVD, dove la chirurgia viene solitamente eseguita solo quando il disco viene distrutto globalmente. Quando si ottiene tessuto da donatori umani dalla sala operatoria, il tessuto è anche altamente frammentato ed è necessario allocare correttamente il tessuto a uno dei tre tipi di cartilagine dell’IVD prima di effettuare ulteriori analisi. Per consentire analisi più dettagliate anche di sezioni tissutali più grandi e per esaminare lo sviluppo embrionale dell’IVD è quindi necessaria la scelta di un organismo modello animale.

Quando si sceglie un tale organismo modello è importante avere un sistema che sia paragonabile al disco umano per quanto riguarda la sua anatomia e le sue dimensioni, il suo carico meccanico, l’attuale popolazione cellulare e la sua composizione tissutale. Ai fini della tecnica qui presentata suggeriamo l’uso del tessuto del disco lombare bovino: Una proprietà critica del disco umano con conseguente suo basso potenziale rigenerativo è la perdita di cellule notocordali durante la maturazione nel nucleo. Tuttavia, in numerosi organismi modello le cellule notocordali possono essere rilevate per tutta la loro vita. La maggior parte dei pochi animali che perdono le loro cellule notocordali come pecore, capre o cani condrodistrofi hanno un IVD che è molto più piccolo dei dischi umani. Solo i dischi bovini lombari presentano un diametro del disco sagittale paragonabile a quelli degli IVD umani¹⁵.

Un fattore chiave che porta alla degenerazione precoce del disco è l’eccessivo carico meccanico. Le pressioni intradiscali di una mucca in piedi nella colonna lombare sono di circa 0,8 MPa con la colonna vertebrale allineata orizzontalmente. Sorprendentemente queste pressioni sono paragonabili alle pressioni intradiscali lombari riportate per la colonna vertebrale umana eretta (0,5 MPa)^15,16. Anche la quantità di acqua e proteoglicani nei dischi bovini è paragonabile a quella dell’IVD dei giovani^{umani 17}. Pertanto, sebbene il modello di movimento effettivo dei segmenti di movimento possa differire negli animali quadrupedi dall’uomo bipede, per quanto riguarda il carico totale e le caratteristiche del disco, la mucca è molto più vicina alla biologia umana rispetto ad altri modelli animali stabiliti per l’IVD come pecore e cani.

In questo protocollo presentiamo una tecnica come analizzare i cambiamenti nell’IVD dal punto di vista dell’organizzazione spaziale dei condrociti dallo sviluppo embrionale precoce alla degenerazione dello stadio terminale.

Protocol

Per l’analisi dello sviluppo e della maturazione embrionale sono stati utilizzati dischi bovini. Per valutare la degenerazione dell’IVD, sono stati analizzati campioni umani. Il tessuto IVD umano è stato ottenuto da pazienti sottoposti a intervento chirurgico per degenerazione del disco lombare, prolasso del disco o trauma spinale nel Dipartimento di Chirurgia Ortopedica, nell’Ospedale Universitario di Tubinga e nel BG Trauma Centre Tübingen. La piena approvazione del comitato etico è stata…

Representative Results

Utilizzando immagini a mosaico, l’architettura dell’IVD con la sua fitta rete di fibre di collagene nell’anolo e il nucleo più morbido può essere chiaramente riconosciuta (Figura 4). Una continua diminuzione della densità cellulare può essere osservata durante lo sviluppo embrionale (Figura 5). Mentre nelle prime fasi dello sviluppo dell’IVD si può trovare una densità cellulare di 11.435 cellule/mm² nell’anulus fibrosus bovino e 17.426 cellule/mm² nel nu…

Discussion

Utilizzando la microscopia a fluorescenza aumentata dall’imaging a mosaico e dal sezionamento ottico, abbiamo valutato la disposizione spaziale dei condrociti nell’anoulus dell’IVD lombare durante lo sviluppo, la maturazione e la degenerazione. Mentre il tessuto degenerativo poteva essere raccolto da pazienti sottoposti a chirurgia della colonna vertebrale per la degenerazione del disco, l’analisi del periodo embrionale e della fase di maturazione richiedeva l’uso di un organismo modello (bovino). Alte densità cellulari…

Materials

Amphotericin B	Merck KGaA,  Germany	A2942
Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus	R. Langenbrinck, Germany	03-0060
ApoTome	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	462000115
AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany
CellMask Actin Tracking Stain	Thermo Fischer Scientific, US	A57249
Cryostat	Leica Biosystems, US	CM3050S
DAPI	Thermo Fischer Scientific, US	D1306
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Germany	41966052
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich, US	60004
Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	3834000604
Formaldehyde	Merck KGaA,  Germany	104002
Image J 1.53a, with Cell counter plugin	National Insittute of Health (NIH), US
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin	Thermo Fischer Scientific, US	A12380
Microscopic Cover Glasses	R. Langenbrinck, Germany	01-1818/1
PAP Pen Liquid Blocker	Science Sevices  GmbH, Germany	N71310
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, US	P4333
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich,US	P5119
Scalpel	pf medical AG, Germany	2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Netherlands	SA6255012