배아 개발에서 퇴화까지 의 상호 디스크의 광학 단면 및 시각화
Summary
우리는 광학 단면 법을 사용하여 추간판의 골문 섬유증에서 공간 연골 세포 조직을 조사하는 방법을 제시한다.
Abstract
무척추 동물 디스크 (IVD) 변성은 요통의 주요 원인이며 영향을받는 개인을위한 높은 수준의 손상을 수반합니다. 디스크 퇴행성을 해독하고 재생 접근법을 개발할 수 있도록 IVD의 세포 생물학에 대한 철저한 이해가 필수적이다. 아직도 대답되지 않는 남아 있는 이 생물학의 한 양상은 세포가 생리적인 상태 및 변성 도중 공간적으로 배열되는 방법의 질문입니다. IVD의 생물학적 특성과 가용성은 이 조직을 분석하기 어렵게 만듭니다. 본 연구는 초기 배아 발달에서 말기 변성까지 골문 섬유증에 있는 공간 연골세포 조직을 조사합니다. 광학 단면방법(Apotome)은 척추 수술을 받은 환자로부터 얻은 동물 모델 및 인간 디스크 조직으로서 소 배아 조직을 이용한 고해상도 염색 분석을 수행하기 위해 적용된다. 초기 배아 소 디스크에서 매우 높은 연골 세포 밀도에서, 세포의 수는 임신, 성장 및 성숙 도중 감소합니다. 인간 디스크에서, 세포 밀도의 증가는 조직 퇴화의 진행을 동반. 이미 관절 연골에서 입증 된 바와 같이, 클러스터 형성은 고급 디스크 변성의 특징을 나타냅니다.
Introduction
무척추 디스크(IVD)는 생화학적으로 세포 건축과 관련하여, 첫눈에, 여러 가지 면에서 관절 연골1과유사한 연골 계 구조이다. 실제로, 관절 연골의 IVD 변성 및 골관절염(OA)은 연골 마모, 부전성 낭종 및 골관절염 형성, 및 아전철 경화증2,3로인한 관절 공간 협종화를 특징으로 한다. 이러한 유사성에도 불구하고 두 조직의 아키텍처와 기능적 역할이 다릅니다. 관절 연골의 매트릭스는 주로 아케이드 형성 콜라겐 형 II 네트워크로 형성되는 동안, IVD는 조직의 세 가지 유형으로 구성되어 있습니다 : 중앙에 콜라겐 유형 II 풍부한 핵 pulposus는 축부하를 차지하고 축부하를 소요하고 축섬유라고 조밀하게 포장 된 원형 콜라겐 유형 I 섬유의 포괄 링으로 전송. 이들의 기능은 장방향 섬유 강도로 프로테오글리칸 및 물이 풍부한 핵에 의해 수신된 번역된 축 압력을 흡수하는 것이다. 각 핵및 항문의 위쪽과 하단에서 hyaline 카르틸라기나기드 엔드플레이트는 인접한 척추4(도 1)에접합을 형성한다.
관절 연골에서, 네 개의 뚜렷한 공간 연골 패턴을 찾을 수 있습니다 : 쌍, 문자열, 이중 문자열, 작은 각각 큰 클러스터5,6,7 (그림 2). 이 패턴의 변화는 OA 발병 및 진행8,9와관련이 있습니다. 공간 연골세포 조직은 또한 연골의 직접적인 기능적 특성, 즉 강성, 이러한 이미지 기반 정지접근법(10,11)의기능적 관련성을 밑줄이 있다. 이러한 패턴은 이미 존재하는 임상 용기술(12)으로추가로 식별할 수 있다. IVD와 관절 연골 사이의 유사성으로 인해, IVD에 특징적인 연골세포 패턴도 존재한다는 가설이 될 수 있다. 클러스터 형성은 또한 퇴화IVD(13,14)에서관찰되는 현상이다.
IVD에서 공간 세포 조직을 분석하려고 할 때, 관절 연골을 조사 할 때 존재하지 않는 몇 가지 기술적 어려움을 극복 할 필요가있다 :
첫째, 조직 자체의 처리는 주로 콜라겐 유형 II로 구성된 균일 한 hyaline 연골보다 훨씬 더 도전적이다. IVD의 주요 섬유 성분은 콜라겐 타입 I로 얇은 히스토닉 섹션을 생성하기가 훨씬 더 어려워집니다. hyaline 관절 연골에서도 두꺼운 단면도 조직의 “유리와 같은”특성으로 인해 쉽게 분석 할 수 있지만, IVD의 콜라겐 타입 I 네트워크는 광학적으로 뚫을 수 없습니다. 이러한 이유로, 강한 배경 잡음은 IVD의 히스토로지에서 일반적인 문제입니다. 이 광학적으로 조밀 한 조직을 관통하는 빠르고 저렴한 방법은 예를 들어, 아포토메를 통해 광학 단면 장치의 사용입니다. 이러한 종말에서, 그리드는 기존의 형광 현미경의 조명 경로에 삽입된다. 그리드 앞에 평면 병렬 유리 판이 배치됩니다. 이렇게 하면 이미지의 그리드를 세 가지 다른 위치로 투영합니다. 각 z 위치에 대해 투영된 그리드가 있는 세 개의 원시 이미지가 만들어지고 중첩됩니다. 특수 소프트웨어를 통해 초점 표시등을 계산할 수 있습니다. 기본 원칙은 그리드가 보이면 해당 정보가 초점이 맞추어져 있지 않으면 초점이 맞춰져 있지 않다는 것입니다. 이 기술을 사용하면 집중력이 잘 되고 고해상도 이미지를 합리적인 시간 으로 획득할 수 있습니다.
둘째, 조직은 인간 기증자에게서 오기 어렵습니다. 총 무릎 교체를 할 때, 관절의 전체 표면은 수술 중 추가 분석을 위해 얻을 수있다. 이질관절의 골관절염은 전체 관절의 질병이기도 하지만, 그럼에도 불구하고 관절의 일부 영역이 여전히 손상되지 않은 연골의 질에 강한 초점 차이가 있다, 예를 들어 그 지역에 있는 감소 된 적재로 인해. 이 상황은 IVD에서 다르며, 수술은 일반적으로 디스크가 전 세계적으로 파괴 될 때만 수행됩니다. 수술실에서 인간 기증자로부터 조직을 획득할 때, 조직은 또한 고도로 단편화되고 추가 분석을 수행하기 전에 IVD의 3개의 연골 유형 중 하나에 조직을 정확하게 할당할 필요가 있다. 또한 더 큰 조직 섹션의 더 상세한 분석을 허용하고 IVD의 배아 발달을 조사하기 위해 동물 모델 유기체의 선택은, 따라서, 필요하다.
이러한 모델 유기체를 선택할 때 해부학 및 치수, 기계적 적재, 현재 세포 인구 및 조직 구성에 대해 인간 디스크와 유사한 시스템을 갖는 것이 중요합니다. 여기에 제시 된 기술의 목적을 위해 우리는 소 요추 디스크 조직의 사용을 제안 : 낮은 재생 잠재력의 결과로 인간 디스크의 중요한 속성은 핵에서 성숙하는 동안 노토 코드 세포의 손실입니다. 그러나, 수많은 모형 유기체에서 notochordal 세포는 그들의 일생 내내 오래 검출될 수 있습니다. 양, 염소 또는 연골 디스트로피개와 같은 노토코드 세포를 잃는 소수의 동물대부분은 인간의 디스크보다 훨씬 작은 IVD를 가지고 있습니다. 인간 IVDs15의것과 비교 가능한 처진 디스크 직경을 가진 요추 소 디스크만 존재한다.
초기 디스크 변성으로 이어지는 핵심 요소는 과도한 기계적 적재입니다. 요추 척추에 서있는 소의 무분별한 압력은 척추가 수평으로 정렬 된 약 0.8 MPa입니다. 놀랍게도 이러한 압력은 발립 인간 척추 (0.5 MPa)15,16에대해보고 된 요추 내 내 압력에 필적한다. 또한 소 디스크의 물과 프로테오글리칸의 양은 젊은인간(17)의IVD와 비슷하다. 따라서, 모션 세그먼트의 실제 이동 패턴은 바이페달 인간으로부터 쿼드러페달 동물에서 다를 수 있지만, 총 적재 및 디스크 특성에 대하여, 소는 양과 개와 같은 IVD에 대한 다른 확립된 동물 모델보다 인간 생물학에 훨씬 더 가깝습니다.
이 프로토콜에서 우리는 초기 배아 발달에서 종말 단계 변성까지 공간 연골세포 조직의 관점에서 IVD의 변화를 분석하는 방법을 기술을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모자이크 이미징 및 광학 단면에 의해 증강된 형광 현미경법을 사용하여, 개발, 성숙 및 변성을 통해 요추 IVD의 항문에서 연골 세포의 공간 배열을 평가했습니다. 퇴행성 조직은 디스크 퇴화를 위한 척추 수술을 받은 환자로부터 수확될 수 있지만, 배아 기간 및 성숙 단계의 분석은 모형 유기체(소)의 사용을 요구하였다. 높은 세포 밀도는 초기 배아 발달 도중 항문에서 주의되었습니다. 개발의 추?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 도움과 지원에 대한 원래 출판물에서 우리의 공동 저자에게 감사드립니다. 우리는 종말 이미지를 취득하는 데 도움 샬롯 엠마 밤버거 감사합니다.
Materials
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
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