Seccionamiento óptico y visualización del disco intervertebral desde el desarrollo embrionario hasta la degeneración
Summary
Presentamos un método para investigar la organización espacial de los condrocitos en el anillo fibroso del disco intervertebral utilizando un método de seccionamiento óptico.
Abstract
La degeneración del disco intervertebral (IVD) es una de las principales causas de dolor lumbar y conlleva un alto grado de deterioro para los individuos afectados. Para decodificar la degeneración del disco y poder desarrollar enfoques regenerativos es esencial una comprensión profunda de la biología celular de la IVD. Un aspecto de esta biología que aún permanece sin respuesta es la cuestión de cómo las células están organizadas espacialmente en un estado fisiológico y durante la degeneración. Las propiedades biológicas del IVD y su disponibilidad hacen que este tejido sea difícil de analizar. El presente estudio investiga la organización espacial de los condrocitos en el anillo fibroso desde el desarrollo embrionario temprano hasta la degeneración en etapa terminal. Se aplica un método de seccionamiento óptico (Apotoma) para realizar análisis de tinción de alta resolución utilizando tejido embrionario bovino como modelo animal y tejido de disco humano obtenido de pacientes sometidos a cirugía de columna. A partir de una densidad de condrocitos muy alta en el disco bovino embrionario temprano, el número de células disminuye durante la gestación, el crecimiento y la maduración. En los discos humanos, un aumento en la densidad celular acompañó la progresión de la degeneración tisular. Como ya se había demostrado en el cartílago articular, la formación de grupos representa un rasgo característico de la degeneración avanzada del disco.
Introduction
El disco intervertebral (IVD) es una estructura basada en cartílago que bioquímicamente y con respecto a la arquitectura celular, a primera vista, se asemeja en muchos aspectos al cartílago articular1. De hecho, tanto la degeneración ivD como la osteoartritis (OA) del cartílago articular se caracterizan por el estrechamiento del espacio articular debido al desgaste del cartílago, el quiste subcondral y la formación de osteofitos, y la esclerosis subcondral2,3. A pesar de estas aparentes similitudes, la arquitectura y el papel funcional de ambos tejidos difieren. Mientras que la matriz del cartílago articular está formada principalmente por una red de colágeno tipo II formadora de arcadas, la IVD consiste en tres tipos diferentes de tejido: el núcleo pulposo rico en colágeno tipo II en el centro toma cargas axiales y las transmite a un anillo abarcador de fibras circulares de colágeno tipo I densamente empaquetadas que se llama anulus fibrosus. Su función es absorber las presiones axiales traducidas recibidas por el núcleo rico en proteoglicanos y agua con su resistencia a la tracción de la fibra longitudinal. En la parte superior e inferior de cada núcleo y anillo, una placa terminal cartilaginosa hialina forma la unión con las vértebras adyacentes4 (Figura 1).
En el cartílago articular, se pueden encontrar cuatro patrones de condrocitos espaciales distintos: pares, cuerdas, cuerdas dobles, pequeños grupos grandes respectivamente5,6,7 (Figura 2). Los cambios en este patrón se asocian con el inicio y la progresión de la OA8,9. La organización espacial de los condrocitos también es indicativa de una propiedad funcional directa del cartílago, a saber, su rigidez, lo que subraya la relevancia funcional de este enfoque de clasificación basado en imágenes10,11. Estos patrones también se pueden identificar con la tecnología ya existente disponible clínicamente12. Debido a las similitudes entre el IVD y el cartílago articular, se puede plantear la hipótesis de que los patrones característicos de condrocitos también están presentes en el IVD. La formación de cúmulos es un fenómeno también observado en la IVD degenerada13,14.
Al tratar de analizar la organización celular espacial en la IVD, es necesario superar varias dificultades técnicas que no están presentes al investigar el cartílago articular:
En primer lugar, el procesamiento del tejido en sí es mucho más difícil que con el cartílago hialino homogéneo que se compone en gran parte de colágeno tipo II. El principal componente de fibra del IVD es el colágeno tipo I, lo que hace que sea mucho más difícil generar secciones histológicas delgadas. Mientras que en el cartílago articular hialino incluso las secciones gruesas se pueden analizar fácilmente debido a la naturaleza “similar al vidrio” del tejido, la red de colágeno tipo I de la IVD es ópticamente altamente impenetrable. Por esta razón, un fuerte ruido de fondo es un problema común en la histología de la IVD. Una forma rápida y barata de penetrar en este tejido ópticamente denso es el uso de un dispositivo de seccionamiento óptico, por ejemplo, por medio de un apotoma. En un apotoma de este tipo, se inserta una rejilla en la vía de iluminación de un microscopio de fluorescencia convencional. Frente a la rejilla se coloca una placa de vidrio plano-paralela. Esto se inclina hacia adelante y hacia atrás, proyectando así la cuadrícula en la imagen en tres posiciones diferentes. Para cada posición z, se crean y superponen tres imágenes sin procesar con la cuadrícula proyectada. Por medio de un software especial, se puede calcular la luz desenfocada. El principio subyacente es que, si la cuadrícula es visible, esa información está enfocada, si no se considera que está fuera de foco. Con esta técnica, se pueden adquirir imágenes bien enfocadas y de alta resolución en un tiempo razonable.
En segundo lugar, el tejido es difícil de obtener de donantes humanos. Al realizar un reemplazo total de rodilla, se puede obtener toda la superficie de la articulación para un análisis adicional durante la cirugía. Aunque la osteoartritis de una articulación diartrodial también es una enfermedad de toda la articulación, sin embargo, existen fuertes diferencias focales en la calidad del cartílago, con generalmente algunas áreas de la articulación aún intactas, por ejemplo, debido a la reducción de la carga en esa área. Esta situación es diferente en la IVD, donde la cirugía generalmente solo se realiza cuando el disco se destruye globalmente. Al obtener tejido de donantes humanos de la sala de operaciones, el tejido también está altamente fragmentado y es necesario asignar correctamente el tejido a uno de los tres tipos de cartílago de la IVD antes de realizar más análisis. Por lo tanto, para permitir análisis más detallados de secciones de tejido también más grandes y para analizar el desarrollo embrionario del IVD, es necesaria la elección de un organismo modelo animal.
Al elegir un organismo modelo de este tipo, es importante tener un sistema que sea comparable con el disco humano con respecto a su anatomía y dimensiones, su carga mecánica, la población celular actual y su composición tisular. Para el propósito de la técnica presentada aquí sugerimos el uso de tejido de disco lumbar bovino: Una propiedad crítica del disco humano que resulta en su bajo potencial regenerativo es la pérdida de células notacordales durante la maduración en el núcleo. Sin embargo, en numerosos organismos modelo se pueden detectar células notocordales durante toda su vida. La mayoría de los pocos animales que pierden sus células notacordales, como ovejas, cabras o perros condrodistrofijos, tienen un IVD que es mucho más pequeño que los discos humanos. Sólo los discos bovinos lumbares presentan un diámetro de disco sagital comparable a los de los IVD humanos15.
Un factor clave que conduce a la degeneración temprana del disco es la carga mecánica excesiva. Las presiones intradiscales de una vaca de pie en la columna lumbar son de alrededor de 0,8 MPa con la columna vertebral alineada horizontalmente. Sorprendentemente estas presiones son comparables a las presiones intradiscales lumbares reportadas para la columna vertebral humana erecta (0.5 MPa)15,16. También la cantidad de agua y proteoglicanos en los discos bovinos es comparable a la del IVD de humanos jóvenes17. Por lo tanto, aunque el patrón de movimiento real de los segmentos de movimiento puede diferir en los animales cuadrúpedos del humano bípedo, con respecto a la carga total y las características del disco, la vaca está mucho más cerca de la biología humana que otros modelos animales establecidos para la IVD, como ovejas y perros.
En este protocolo presentamos una técnica de cómo analizar los cambios en la IVD desde el punto de vista de la organización espacial de los condrocitos desde el desarrollo embrionario temprano hasta la degeneración terminal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando microscopía de fluorescencia aumentada por imágenes de mosaico y seccionamiento óptico, evaluamos la disposición espacial de los condrocitos en el anillo de la IVD lumbar durante todo el desarrollo, la maduración y la degeneración. Si bien se podía extraer tejido degenerativo de pacientes que recibían cirugía de columna vertebral para la degeneración del disco, el análisis del período embrionario y la fase de maduración requería el uso de un organismo modelo (bovino). Se observaron altas densidad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a nuestros coautores de las publicaciones originales por su ayuda y apoyo. Agradecemos a Charlotte Emma Bamberger por ayudar a adquirir las imágenes del apotoma.
Materials
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope – Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. . Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated’: a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
