Summary
אנו מציגים שיטה לחקור ארגון כונדרוציטים מרחבי בסיברווס אנולוס של הדיסק הבין חולייתי בשיטת חתך אופטית.
Abstract
ניוון דיסק בין חולייתי (IVD) הוא גורם מוביל לכאבי גב תחתון והוא כרוך במידה גבוהה של פגיעה עבור אנשים מושפעים. כדי לפענח ניוון דיסק ולהיות מסוגל לפתח גישות התחדשות הבנה יסודית של הביולוגיה התאית של IVD הוא חיוני. היבט אחד של ביולוגיה זו שעדיין נותר ללא מענה הוא השאלה כיצד תאים מסודרים מרחבית במצב פיזיולוגי ובמהלך ניוון. המאפיינים הביולוגיים של IVD וזמינותו מקשים על ניתוח רקמה זו. המחקר הנוכחי חוקר ארגון כונדרוציטים מרחבי בסיברווס אנולוס מהתפתחות עוברית מוקדמת ועד ניוון סופני. שיטת חתך אופטית (Apotome) מוחלת כדי לבצע ניתוחי כתמים ברזולוציה גבוהה באמצעות רקמת עובר בקר כמודל בעלי חיים ורקמת דיסק אנושית המתקבלת מחולים שעברו ניתוח בעמוד השדרה. מתוך צפיפות כונדרוציטים גבוהה מאוד בדיסק בקר עוברי מוקדם, מספר התאים פוחת במהלך ההריון, הצמיחה וההתבגרות. בדיסקים אנושיים, עלייה בצפיפות התאים ליוותה את התקדמות ניוון הרקמות. כפי שכבר הוכח בסחוס מפרקי, היווצרות אשכול מייצג תכונה אופיינית של ניוון דיסק מתקדם.
Introduction
הדיסק הבין חולייתי (IVD) הוא מבנה מבוסס סחוס, כי ביוכימית וביחס לארכיטקטורה הסלולר, ממבט ראשון, דומה במובנים רבים הסחוס המפרקי1. ואכן, הן ניוון IVD והן דלקת מפרקים ניוונית (OA) של סחוס מפרקים מאופיינים על ידי צמצום שטח משותף עקב שחיקת סחוס, ציסטה תת-כונדרית היווצרות אוסטאופיפט, וטרשת תת-ביתית2,3. למרות הדמיון לכאורה הזה ארכיטקטורה ותפקיד תפקודי של שתי הרקמות שונים. בעוד המטריצה של סחוס מפרקי נוצרת בעיקר מרשת קולגן מסוג II היוצרת ארקייד, ה- IVD מורכב משלושה סוגים שונים של רקמות: פולפוס הגרעין העשיר בקולגן II במרכז תופס עומסים ציריים ומעביר אותם לטבעת מקיפה של סיבי קולגן עגולים מסוג I צפופים הנקראים סינולוס סיביים. תפקידם הוא לספוג את הלחצים הארזיים המתורגמים המתקבלים על ידי הגרעין הפרוטאוגליקני והעשיר במים עם חוזק הסיבים האורך המתוח שלהם. בחלק העליון והתחתון של כל גרעין ואנולוס, לוחית קצה קרטלגינית היאלין יוצרת את הצומת לחוליות הסמוכות4 (איור 1).
בסחוס מפרקי ניתן למצוא ארבעה דפוסי כונדרוציטים מרחביים נפרדים: זוגות, מחרוזות, מחרוזות כפולות, אשכולות קטנים בהתאמה גדולים5,6,7 ( איור2). שינויים בתבנית זו משויכים להתפרצות OA ולהתקדמות8,9. ארגון chondrocyte מרחבי מעיד גם על מאפיין פונקציונלי ישיר של סחוס, כלומר נוקשותו, הדגיש את הרלוונטיות התפקודית של גישה זו דירוג מבוסס תמונה10,11. דפוסים אלה יכולים גם להיות מזוהים עם טכנולוגיה כבר קיים קליני זמין12. בשל הדמיון בין IVD וסחוס מפרקי, ניתן לשער כי דפוסי chondrocyte אופייניים נמצאים גם בעירוי. היווצרות אשכול היא תופעה שנצפתה גם בהבחנה מנוונת13,14.
כאשר מנסים לנתח ארגון סלולרי מרחבי בעירוי, יש צורך להתגבר על מספר קשיים טכניים שאינם קיימים בעת חקירת סחוס מפרקי:
ראשית, עיבוד הרקמה עצמה הוא הרבה יותר מאתגר מאשר עם סחוס היאלין הומוגני אשר מורכב בעיקר קולגן סוג II. רכיב הסיבים העיקרי של ה-IVD הוא קולגן מסוג I, מה שמקשה הרבה יותר על יצירת מקטעים היסטולוגיים דקים. בעוד בסחוס מפרקי היאלין אפילו חלקים עבים ניתן לנתח בקלות בשל אופי "דמוי זכוכית" של הרקמה, סוג הקולגן I רשת של IVD הוא אופטי מאוד בלתי חדיר. מסיבה זו, רעש רקע חזק הוא בעיה נפוצה בהצטולוגיה של IVD. דרך מהירה וזולה לחדור לרקמה צפופה אופטית זו היא שימוש במכשיר חתך אופטי למשל, באמצעות אפופוטם. באפוטום כזה, רשת מוכנסת במסלול התאורה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. מול הרשת מונחת צלחת זכוכית מקבילה למטוס. פעולה זו נוטה קדימה ואחורה ובכך מקרינת את הרשת בתמונה בשלושה מיקומים שונים. עבור כל מיקום z, שלוש תמונות גולמיות עם הרשת המוקרנת נוצרות ומונחות על-גבי. באמצעות תוכנה מיוחדת, ניתן לחשב את האור מחוץ למיקוד. העיקרון הבסיסי הוא שאם הרשת גלויה, המידע הזה נמצא במוקד, אם לא הוא נחשב לא ממוקד. עם טכניקה זו, תמונות ממוקדות היטב ברזולוציה גבוהה ניתן לרכוש בפרק זמן סביר.
שנית, קשה להשיג את הרקמה מתורמים אנושיים. בעת ביצוע החלפת ברך מוחלטת, ניתן להשיג את כל פני השטח של המפרק לניתוח נוסף במהלך הניתוח. למרות דלקת מפרקים ניוונית של מפרק diarthrodial היא גם מחלה של המפרק כולו, ישנם בכל זאת הבדלים מוקדיים חזקים באיכות הסחוס עם בדרך כלל כמה אזורים של המפרק עדיין להיות שלם, למשל בשל עומס מופחת באזור זה. מצב זה שונה בהפריה הVD, שם הניתוח מבוצע בדרך כלל רק כאשר הדיסק נהרס ברחבי העולם. בעת קבלת רקמות מתורמים אנושיים מחדר הניתוח, הרקמה גם מקוטעת מאוד ויש צורך להקצות כראוי את הרקמה לאחד משלושת סוגי הסחוס של ה- IVD לפני ביצוע ניתוחים נוספים. כדי לאפשר ניתוחים מפורטים יותר של קטעי רקמות גדולים יותר ולבדוק את ההתפתחות העוברית של IVD הבחירה של אורגניזם מודל בעלי חיים היא, אם כן, הכרחית.
בעת בחירת אורגניזם מודל כזה חשוב שתהיה מערכת הדומה לדיסק האנושי ביחס לאנטומיה ומידותיו, העמסה המכנית שלו, אוכלוסיית התא הנוכחית כמו גם הרכב הרקמה שלה. לצורך הטכניקה המוצגת כאן אנו מציעים את השימוש ברקמת דיסק מותני בקר: מאפיין קריטי של הדיסק האנושי וכתוצאה מכך הפוטנציאל ההתחדשותי הנמוך שלו הוא אובדן תאים לא-רדודליים במהלך ההבשלה בגרעין. עם זאת, במודלים רבים אורגניזמים notochordal תאים ניתן לזהות כל חייהם. לרוב בעלי החיים המעטים שמאבדים את התאים הלא-נוכרודים שלהם כמו כבשים, עזים או כלבי כונדרודיסטרופיג יש IVD שהוא קטן בהרבה מדיסקים אנושיים. רק דיסקים מותניים של בקר נוכחים עם קוטר דיסק קשתי דומה לאלה של IVDs אנושי15.
גורם מפתח המוביל לניוון דיסק מוקדם הוא טעינה מכנית מוגזמת. הלחצים התוך-ממדיים של פרה עומדת בעמוד השדרה המותני הם בסביבות 0.8 MPa כשעמוד השדרה מיושר אופקית. באופן מפתיע לחצים אלה דומים ללחצים התוך-דיקליים המותניים שדווחו לעמוד השדרה האנושי הזקוף (0.5 MPa)15,16. גם כמות המים ופרוטוגליקנים בדיסקים של בקר דומה לזו של ה- IVD מבני אדם צעירים17. לכן, למרות שדפוס התנועה בפועל של מקטעי התנועה עשוי להיות שונה בבעלי חיים מרובעים מהאדם הדו-רגליים, ביחס למאפייני הטעינה והדיסק הכוללים, הפרה קרובה הרבה יותר לביולוגיה האנושית מאשר מודלים בעלי חיים מבוססים אחרים עבור IVD כגון כבשים וכלבים.
בפרוטוקול זה אנו מציגים טכניקה כיצד לנתח שינויים בהפריה חוץ גופית מנקודת המבט של ארגון כונדרוציטים מרחבי מהתפתחות עוברית מוקדמת ועד ניוון שלב הסיום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לניתוח התפתחות עוברית והבשלה, נעשה שימוש בדיסקים של בקר. כדי להעריך את ניוון ההפרה ההפרה,דגימות אנושיות נותחו.
רקמת IVD אנושית התקבלה מחולים שעברו ניתוח לניוון דיסק מותני, צניחת דיסק או טראומה בעמוד השדרה במחלקה לכירורגיה אורתופדית, בבית החולים האוניברסיטאי של טיבינגן ובמרכז הטראומה BG Tübingen. אישור מלא של ועדת האתיקה התקבל לפני תחילת המחקר (פרויקט מספר 244/2013BO2). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני ההשתתפות. השיטות בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו.
רקמת בקר התקבלה ממשרד הבריאות והבטיחות במזון של בוואריה/אוברשלהיים וממפעל עיבוד בוורטאוסן (גרמניה). אישור הרשויות המקומיות והווטרינריות התקבל לרקמה מבעלי חיים מתים.
1. קציר מדגם
- רקמת IVD אנושית: יש להניח דגימות IVD שהושגו תוך ניתוח באופן מיידי במדיום הנשר המעודכן (DMEM) של Dulbecco עם 2% (v/v) של פניצילין-סטרפטומיצין ו-1.2% (v/v) אמפטריצין B. חנות ב-4 °C עד לעיבוד נוסף. לעבד את הרקמה בתוך 48 שעות. לחלופין, לאחסן את הרקמות ב -20 °C (70 °F) במשך מספר שבועות.
- רקמת IVD בקר: הקפד לקצור את הרקמה מבעלי החיים בתוך 24 שעות לאחר המוות.
תחברו את דיסקי הקרן עם החוליות שמסביב מהחיות המתות. מעבירים את הרקמה הקפואה על קרח יבש ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.
הערה: אם רק ניתוחי פלואורסצנטיות נועדו ולא מתוכננות שיטות כימות ביוכימיות נוספות כגון ELISA או PCR, בצע את קיבוע הרקמות כפי שהוסבר להלן. זה מאפשר לשמור על הרקמה זמן רב יותר באחסון לפני שהוא צריך להיות מעובד. כדי למנוע הידרדרות של מטריצת הרקמה, לבצע קיבעון בתוך 48 שעות לאחר הקציר אלא אם כן הרקמה קפואה ישירות.
2. הכנת מדגם
- להפשיר את הרקמה הקפואה בטמפרטורת החדר. לעבד את הרקמה ברגע שאין קרח גבישים ניתן להרגיש יותר על דחיסה עדינה דיגיטלית של הרקמה.
הערה: לבצע את הכנת הרקמה ב- DMEM בצלחת פטרי. - זהה את מקור רקמת ההVD האנושית (אנולוס פיברווס, אזור ביניים, גרעין פולפוס או לוחית קצה סחוס) בהתבסס על תכונות מקרוסקופיות כגון צפיפות קולגן וכיוון.
- קח את קטע התנועה המורכב מדיסק IVD בקר עם שתי החוליות הסמוכות שלו וניתח את הדיסק בכללותו מהעצם התת-שכונתית באמצעות להב כירורגי (להב מספר 15).
- השתמש בשני מלקחיים אנטומיים כדי להפוך את הדיסק כדי להגיע לאזורים מרוכזים יותר. בצע את הניתוח. ודא לectect את גרעין pulposus האחרון כפי שהוא הרבה יותר רזה מאשר אנולוס, נוטה לקרוע, וזה לא יורד בצורה מוגדרת בקלות.
- זהה את האזורים השונים של הסחוס.
- לגזור את שטח העניין מן הדיסק כולו באמצעות להב כירורגי (להב מספר 20 או 22). לחלופין, השתמש בלהב קריוטום.
הערה: כאשר דיסקי בקר מגיעים כחלק מעמוד השדרה, ניתן להכין את הדיסקים ב- toto. זה עושה זיהוי נכון של סוגים שונים של סחוס הרבה יותר קל. בעת ניתוח הדיסק בצורה המתוארת לעיל, לוחית הקצה הקרטלגינית נשארת על החוליות. אם אזור זה ייחקר, עדיף להוריד אותו מהעצם הבסיסית עם אזמל עובד בכיוון משיק מעט כפוף.
- במקרה שהעוברים הם באורך כתר-ישבן של קטן מ -20 ס"מ, הקפד לעבד את העוברים טוטו כדי לשמר את ארכיטקטורת הרקמה של IVD. אין לבצע כל ניתוח של החוליות במקרים אלה.
- לאחר שהדיסק נפלט בטוטו, זהה את האזורים השונים של הסחוס.
- בצע את ההסתיידות בחומצה אתילנדימינטראטראצטית (EDTA) (20% (w/v); pH = 7.4) בטמפרטורת החדר. בחר את הנפח בהתאם לגודל המדגם - הרקמה כולה חייבת להיות מכוסה היטב עם EDTA.
- לשנות את פתרון decalcification מדי יום אשר יכול להימשך עד 5 ימים בהתאם לגודל של הרקמה.
- ודא כי ההסתיידות מוצלחת עם מחט 20 מד שחודרת לחוליות ללא התנגדות בולטת.
הערה: השינוי היומי של פתרון הסרת הסתיידות חשוב כדי למנוע קלסר כלאט EDTA מרוויה כדי לשמור על אפקטיות התגובה. זה גם מונע קולוניזציה חיידקית.
3. דירוג גיל המדגם, שלמות והתנוונות
- לסווג את רקמת הדיסק האנושית לאחת מחמש הקטגוריות הבאות בעזרת מידע קליני, כמו גם הדמיית רנטגן ותהודה מגנטית18 (איור 3).
הערה: קטגוריה I: כדי לשמש מדגם כמעט בריא להשתמש אנולוס ללא כל סימן רדיולוגי של ניוון IVD נגזר טראומה עמוד השדרה חריפה.
קטגוריה II: כדי להמחיש מצב של דלקת חריפה עם תחילת ניוון להשתמש ברקמה מאזור הביניים מחולים עם תסמינים קליניים עם משך של פחות מ 4 שבועות.
קטגוריה III: כדי לתאר מצב שבו התגובה הדלקתית כבר היה זמן להשפיע על הרקמה והתאים לקחת רקמה מחולים אשר נותחו עבור צניחה גרעינית אבל עם משך סימפטום העולה על 4 שבועות.
קטגוריה 4: עבור ניוון דיסק מתון בחר אנולוס שהתקבל מניתוח עם היתוך בין גוף למחלת דיסק ניוונית עם ציון Pfirrmann של 3 או 4 בהדמיית תהודה מגנטית19.
קטגוריה V: עבור תהליך ניוון בשלב הסופי אנולוס שהתקבל מניתוח עם היתוך בין גוף למחלת דיסק ניוונית עם ציון Pfirrmann של 5. - לסווג את רקמת בקר בהתבסס על השלב ההתפתחותי / גיל של החיה לאחת משמונה הקטגוריות, כפי שמוצג בטבלה 1.
- חשב את גיל ההיריון על אורך כתר-ישבן של העוברים בהתבסס על הנוסחה המוצעת על ידי קלר:
גיל ההיריון בחודשים =
הערה: בעלי חיים ב 4 השבועות הראשונים של ההריון נוכחים עם אורך כתר-ישבן של 0.8-2.2 ס"מ20.
- חשב את גיל ההיריון על אורך כתר-ישבן של העוברים בהתבסס על הנוסחה המוצעת על ידי קלר:
4. קיבוע רקמות
- לקבע את הדגימות ב 10x את נפח המדגם של 4% (w /v) פורמלדהיד פתרון תמיסת פוספט חוצץ (PBS) במהלך הלילה ב 4 °C (50 °F).
הערה: תמיסת פורמלדהיד חודרת לרקמה בקצב של כ-1 מ"מ לשעה מכל כיוון. עבור דגימות קטנות מאוד או גדולות מאוד ניתן יהיה צורך בהתאמת זמן החשיפה. - לאחסן את הרקמה PBS ב 4 °C (7 °F) עד עיבוד נוסף.
5. חתך היסטולוגי
- הטמע את הדגימות במדיום הטבעה מסיס במים על ידית הקריוטום.
- מניחים את הרקמה על הידית כך שנוצר מישור צירי או מטוס שחותך את סוג הקולגן אני lamellae בניצב (למשל, מישור חתך קשתי חציוני).
הערה: הרקמה צריכה להיות מכוסה במלואה על ידי המדיום המטביע.
- מניחים את הרקמה על הידית כך שנוצר מישור צירי או מטוס שחותך את סוג הקולגן אני lamellae בניצב (למשל, מישור חתך קשתי חציוני).
- חלק את הרקמה המוטמעת בעובי של 70 מיקרומטר בדגימות אנושיות ו 40 מיקרומטר בדגימות בקר באמצעות קריוטום סטנדרטי.
הערה: ההבדל בעובי המקטע נובע מההבדל בשלמות הרקמה בין דיסק בקר שלם לבין הרקמה האנושית המנוונת ביותר. - אסוף את המקטעים במגלשת זכוכית.
- תקיף את מקטעי הרקמה בעט הידרופובי.
- יש לשטוף את המקטעים 3 פעמים עם תמיסת מלח עם פוספט (PBS) כדי להסיר את מדיום ההטבעה המסיס במים.
6. כתמי פלואורסצנטיות
- הוסף 60 μL של 1% (v/v) של DAPI (Exmax 358 ננומטר, Emmax 461 ננומטר) כמו גם 1% (v/v) של מכתמים מעקב Actin (Exmax 540 ננומטר, Emmax 565 ננומטר) ב PBS ודגרה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: פרוטוקול הכתמים המתואר כאן הוא לדמיין את הגרעין באמצעות כתמים גרעיניים DAPI (כחול) ואת הציטופלסמה באמצעות כתם מעקב Actin (אדום). IVD יש autofluorescence חזק בשל סיבי הקולגן בערוץ הירוק. כמות הנוזל שנוספה לסעיפים בפרוטוקול זה מיועדת לחלקים בגודל של כ-5 מ"מ x 5 מ"מ. עבור מקטעים גדולים יותר, יש להגדיל סכום זה בהתאם. בצעו את כל העבודות בחדרים ללא חשיפה ישירה לאור שמש ועם אורות מעומעמים כדי למנוע את ההלבנה של הצבע. - הסר את נוזל הכתמים עם pipette ולשטוף שלוש פעמים עם 60 μL של PBS בכל פעם.
- מוסיפים מדיום הרכבה מתאים ומכסים את המקטעים בתלוש כיסוי.
הערה: ודא שאין בועות אוויר לכודות בעת הוספת שובר הכיסוי. זה נעשה בצורה הטובה ביותר על ידי התחלת מגע של להחליק עם השקופית על שפת אחת ולאחר מכן לתת להחליק לרדת לאט.
7. הדמיה ועיבוד מיקרוסקופיים
- הנח שקופית עם מקטע מוכתם על מחזיק הדגימה של המיקרוסקופ.
הערה: בשל רשת הקולגן הצפופה I של ה- IVD, האור המפוזר מקשה על הרקמה לדמיין באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. אחת ה דרך לטפל בבעיה זו היא לבצע חתך אופטי באמצעות תאורה מובנית. זה גם מאפשר לעבד הקרנה תלת ממדית של הדגימה כולה בשני הערוצים (כחול ואדום). מומלץ לעשות זאת באמצעות הגדרת התאורה המובנית ומצב הפסיפס עם עדשת יעד הגדלה פי 10 כדי לקבל סקירה כללית של המדגם, כמו גם שחזורים תלת-ממדיים של דפוסים בודדים. - הפעל את התקן התאורה המובנה.
- בצע הדמיה שדה ראייה יחיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים, מסנני פלואורסצנטיות ותאורה נאותה.
הערה: התאם את זמן החשיפה עבור כל המסננים המשמשים כדי לתקנן את רכישת ההדמיה. כדי לקבל ייצוג מדויק של הדגימה בתמונה ברזולוציה גבוהה יותר, המקטעים עם הגדלה גבוהה יותר (למשל, המטרה 20x). - לאחר עיבוד התמונות על-ידי מיטוב העוצמה והבהירות באמצעות תוכנת אופטימיזציה של תמונה התואמת למיקרוסקופ הפלואורסצנטיות.
- בצע הדמיה שדה ראייה יחיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים, מסנני פלואורסצנטיות ותאורה נאותה.
- כדי לדמיין את המקטע בכללותו השתמש בטכניקת הדמיית הפסיפס
- פתח את הגדרות הרכישה (לחץ על 6D- Acquisition) מלוח סרגל הכלים.
- התאם את הגדרות הפסיפס (באוגר MosaiX) והגדר את מספר העמודות והשורות של תמונות שדה-מבט שמאוחר יותר ימוזגו לתמונת מבט כולל אחת.
- הקש Setup והתאם את תיקון המוקד של אריחים בודדים.
הערה: זה כמעט בלתי אפשרי עבור סעיף רקמות גדול יש את כל פני השטח רקמה במישור מיקוד אחד. אריחי תמונה ברמות מוקד שונות ניתן לקחת על ידי 'רכישת MosaiX'. - כדי להתחיל ברכישת אריחי התמונה, הקש התחל.
- תפר את האריחים בתמונה באמצעות פונקציית התפירה (לחצןתפירה) עם חפיפה של 20% המשולבת בתוכנה.
- לאחר עיבוד התמונות על-ידי מיטוב העוצמה והבהירות באמצעות תוכנת אופטימיזציה של תמונה התואמת למיקרוסקופ הפלואורסצנטיות.
- כדי לנתח את ארגון chondrocyte המרחבי, השתמש בפונקציה 3D המשולבת בתוכנה.
- התאם את הגדרות מחסנית z. הגדר את פרמטרי הסריקה: הגדר את מיקומי ההתחלה וההפסקה בציר z ואת מרחק הפרוסה על-ידי הפעלת לחצן התחל/עצור.
הערה: התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את מספר הפרוסות. - כדי להתחיל ברכישת ערימות z של התמונה, הקש התחל.
- לאחר עיבוד התמונות על-ידי מיטוב העוצמה והבהירות באמצעות תוכנת אופטימיזציה של תמונה התואמת למיקרוסקופ הפלואורסצנטיות.
- התאם את הגדרות מחסנית z. הגדר את פרמטרי הסריקה: הגדר את מיקומי ההתחלה וההפסקה בציר z ואת מרחק הפרוסה על-ידי הפעלת לחצן התחל/עצור.
- יצא את התמונות בתבנית קובץ התואמת לתוכנת עיבוד התמונה.
הערה: ייצאו את השחזורים בתלת-ממד כתמונות בודדות או /ו כמודל תלת-ממדי אינטראקטיבי או בתבנית וידאו.
8. זיהוי דפוס תאי והערכה של צפיפות
- פתח את תמונות הפסיפס המיוצאות של מקטע הרקמה כולו בתוכנית עיבוד תמונה מתאימה.
- הגדר את האזורים הכפופים להערכת צפיפות תאים על-ידי הגדרת אזורים בעלי עניין של 500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר בתמונות.
הערה: כל האריחים שאין להם איכות תמונה נאותה אינם נכללים בניתוח. - זהה דפוסים תאיים בודדים.
הערה: תאים בודדים מוגדרים כתאים בודדים - אנקפסולציה מלאה בתוך המטריצה הסמוכה. זוגות מוגדרים כשני תאים סמוכים בסמיכות (<25 מיקרומטר) לפיהם התאים מחוברים דרך המטריצה שלהם (ראו איור 2). תצורות מחרוזת הן לפחות שלושה כונדרוציטים מיושרים בשורה (מאמצע הגרעינים <25 מיקרומטר). תאים אלה מוקפים במטריצה שלמה וניתן לראות חיבורי מטריצה בין כל תא. אשכולות מייצגים תאים מרובים הממוקמים בסמיכות ישירה זה לזה (<25 מיקרומטר) והם עטופים בלקונה גדולה נטולת מטריצה. - השתמש ביישום Plug-in של ספירת תאים לניתוח הכמותי של התבניות הסלולריות.
הערה: כתמי הציטופלסמה מייצגים שיטת אימות לזיהוי הדפוסים המרחביים השונים. - חשב את צפיפות התאים על-ידי חלוקת התאים שנספרו לפי גודל אזור העניין שנבחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות תמונות פסיפס, ניתן לזהות בבירור את הארכיטקטורה של ה-IVD עם רשת סיבי הקולגן הצפופה שלו באנולו והגרעין הרך יותר(איור 4). במהלך התפתחות עוברית ניתן לראות ירידה מתמשכת בצפיפות התאים (איור 5). בעוד בשלבים המוקדמים של פיתוח IVD ניתן למצוא צפיפות תאים של 11,435 תאים /מ"מ רבוע בסיבי אנולוס בקר ו 17,426 תאים / מ"מ² בגרעין הבעירה פולפוס, מספרים אלה להקטין במהירות ל 1,011 תאים / מ"מ² (פיברו אנולוס בקר) ו 488 תאים / mm² (גרעין בקר פולפוס) עד הלידה. בבקר הבוגר נראים 71 תאים/מ"מ רבוע (אנולוס סיביוס) 106 תאים/מ"מ רבוע (גרעין פולפוס)(איור 6 A-B). שימוש בהדמיה דו-ערוצית עם האפוטום מאפשר לדמיין את הארכיטקטורה התלת-ממדית של התבניות המרחביות(איור 7).
איור 1. אנטומיה מקרוסקופית של הדיסק הבין חולייתי. ציור סכמטי של הדיסק הבין חולייתי המציג את גרעין הפופוס (אדום), ישירות סביבו את אזור הביניים (ורוד), ולאחר מכן בשכבות מעגליות סביבו סיבי אנולוס. שימו לב לכיוון זווית הדייורי של סוג הקולגן שאני סיבים בסיברו אנולוס. העומס צירי לגרעין יכול אפוא להיות מתורגם לכוחות מתיחה צירית של סיבי הקולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. איור סכמטי של דפוסים ארגוניים מרחביים שונים של כונדרוציטים. בהתאם chondrocytes רקמה נמצאים כמו תאים בודדים, זוגות או מחרוזות סחוס בריא. עם התנוונות החל דפוסים אלה משתנים כדי ליצור מחרוזות כפולות, אשכולות קטנים ולאחר מכן אשכולות גדולים בניוון סופו של שלב. נתון זה שונה מדנאלאש, מ' ואח'21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תנאים שונים של הדיסק הבין חולייתי (IVD). (A-D') הדמיית תהודה מגנטית משוקללת T2 קשתית של עמוד השדרה המותני האנושי (A-D), עם קטע התנועה המוגדל L4 / L5 ( A'-D'). הצד הגחוני של המטופל פונה שמאלה, הצד הימני פונה ימינה עם תעלת עמוד השדרה עם האות הלבן שלו לנוזל השדרתי. (א,א') IVD שלם עם אנולוס מוצג עם אות hypointense (שחור) בשל סוג קולגן גבוה אני תוכן ואת הגרעין הציג הרבה יותר בהיר (hyperintense) בשל התוכן הגבוה של פרוטאוגליקנים מחייב מים (Pfirrmannכיתה 19 I). (ב,ב') החל ניוון IVD עם אובדן אות המים מן גרעין פולפוס ואיפה ההבחנה בין אנולוס גרעין הולך לאיבוד (Pfirrmannכיתה 19 IV). (C, C') צניחה גרעינית חריפה עם אות מים בולט עדיין באזור הגרעין מעידה על עירוי חוץ שלם אחר ורקמת הדיסק הבולטת באופן דורי לתוך תעלת עמוד השדרה. (D,D') ניוון דיסק מתקדם עם IVD נהרס במידה רבה עם אובדן מוחלט של אות המים בתוך הדיסק, היווצרות ספונדילופיט גחון וגרבי וטרשת תת-כונדרית של החוליות המתאימות ל- Pfirrmannכיתה 19 של V. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הדמיית פלואורסצנטיות פסיפס של הדיסק הבין חולייתי (IVD). הארכיטקטורה של ה- IVD עם רשת סיבי הקולגן הצפופה שלה בסיברו אנולוס והגרעין הרך יותר ניתן לזהות בבירור. כתמים DAPI גרעיניים (לבן) במישור צירי (A1) ו sagittal (A2) מציג את התפלגות התא וסידור בתוך IVD. אזורים מייצגים מוגדלים מתמונות פסיפס אלה מוצגים ב- B1-B4 ו- C1-C4 הממחישים את ארגון הכונדרוציט המרחבי - במקרה זה תאים בודדים (תיבה ירוקה), זוגות (תיבה כחולה) ומחרוזות (תיבה צהובה). A: סרגל קנה מידה 1,000 מיקרומטר, B1-B4: סרגל קנה מידה 200 מיקרומטר, C1-C4: סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. נתון זה שונה מבונייר, פ.C ואח '22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. שלבי התפתחות והתבגרות שונים של שבר אנולוס סיבי וסיבי אנולוס מתנוונים אנושיים. מכתים גרעיניים DAPI. תמונות הפסיפס מראות דיסק עוברי מוקדם שלם בקטע צירי (A1) ותמונות מייצגות של אנולוס בקר במהלך התפתחות עוברית, התבגרות והתנוונות התחלתית (A2-A8). (B1-B3) אנולוס מהפריה חוץ גופית אנושית הושג תוך תוך כדי הניתוח. ירידה מתמשכת בצפיפות התאים ניתן לראות במהלך התפתחות דיסק עוברי. נראה כי דפוס תאי של ארגון מרחבי גבוה יותר נוכח במיוחד סביב הלידה. בדיסק האנושי הבוגר במהלך ניוון, הצפיפות התאית עולה שוב וניתן לראות היווצרות אשכול גוברת. סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. שבועות של הריון. נתון זה שונה מבונייר, פ.C ואח '22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. ירידה בצפיפות התאים לאורך כל הפיתוח וההבשלה של הדיסק הבין חולייתי של בקר. ספירת התאים הממוצעת (סטיית תקן) למ"מ-מ"ר מודגמת על ידי דיאגרמות בר עבור שבר אנולוס סיבי(A)וגרעין השבר פולפוס (B). ניתן לראות הפחתה ברורה של צפיפות התאים במיוחד במהלך התקופה העוברית אשר ממשיכה במידה פחותה לפחות עד הבשלה מלאה של הדיסק (n = 72). שבועות של הריון. נתון זה שונה מבונייר, פ.C ואח '22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7. הדמיה אפוטומית של הדיסק הבין חולייתי (IVD). תמונה דו-ערוצית המציגה את הציטופלסמה (אדום, כתמי אקטין) ואת הגרעין (כחול, מכתים גרעיני DAPI). (א)בהפרה חוץ גופית שלמה, בנוסף לתבנית המרחבית השולטת של כונדרוציטים בודדים, נמצאים גם זוגות. (B)באשכולות תאי אנולוס מנוונים ניתן למצוא. סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1. הדמיה אפוטומית של זוג בדיסק הבין חולייתי (IVD) כמודל תלת-ממדי. תמונות דו-ערוציות המציגות את הציטופלסמה (אדום, כתמי אקטין) ואת הגרעין (כחול, מכתים גרעיני DAPI) של זוג. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו 2. הדמיה אפוטומית של אשכול בדיסק הבין חולייתי (IVD) כמודל תלת-ממדי. תמונות דו-ערוציות המציגות את הציטופלסמה (אדום, כתמי אקטין) ואת הגרעין (כחול, מכתים גרעיני DAPI) של אשכול. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
טבלה 1: התפתחות עוברית בקר, התבגרות וצמיחה לאחר הלידה עם אבני הדרך השונות שלה. ווג - שבועות של הריון. תקופת ההיריון כ 283 ימים, תוחלת חיים טבעית 20-25 שנים20,23,24. נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מוגברת על ידי הדמיית פסיפס וחתך אופטי, הערכנו את הסידור המרחבי של כונדרוציטים באנולוס של IVD המותני לאורך כל הפיתוח, ההתבגרות, ניוון. בעוד רקמות ניווניות ניתן לקצור מחולים שקיבלו ניתוח עמוד השדרה עבור ניוון דיסק, ניתוח של התקופה העוברית ושלב ההתבגרות נדרשו שימוש באורגניזם מודל (בקר). צפיפות תאית גבוהה נרשמו אנולוס במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. במהלך הפיתוח הנוסף, צמיחה לאחר ההבשלה והתבגרות ניתן היה לראות ירידה בולטת בצפיפות התאים. ברקמה האנושית עם ניוון דיסק מתקדם, נוכל לכמת עלייה בצפיפות התאים בסיברו של אנולוס.
הגידול המהיר בנפח הרקמות בשילוב עם חלוקה פעילה ותאים נוטוקורדיים פעילים באופן ביו-סינתי הם סיבות סבירות לשינויים בצפיפות התאים שנצפו בעובר25. המנגנונים שבאמצעותם הצפיפות התאית שוב עולה עם ניוון עדיין לא ברורים. תהליכים ניווניים של האנולו מובילים לסדרה של שינויים פתולוגיים כולל פנימיות רקמות מוגברות ודלקת, upregulation של אנזימים משפיל מטריצה וייצור גורם גדילה, וגם שינויים בתאיות26,27,28.
כאשר שוקלים נוכחות תא כפונקציה של ארגון מרחבי תאי המבוסס על דפוסים הידועים סחוס מפרקי7,9 לא מצאנו ארגון מרחבי מוכר בדיסקים עובריים מוקדמים שבהם התאים נראים ארוזים בצפיפות ואשר נחשבנו להיות נוכחים כתאים בודדים22. ממצא זה עולה בקנה אחד עם התוצאות של סחוס מפרקי עוברי7. אנולוס בוגר בריא, תאים בודדים מייצגים את התבנית המרחבית השולטת22. זוגות ותצורות מחרוזת יכולים, עם זאת, גם נצפו22. ככל שהרקמה מנוונת יותר בדיסקים אנושיים, כך שיעור התאים שניתן למצוא באשכולות22גבוה יותר . המודל הפיזיופתולוגי המוצע על ידי רולאף בסחוס מפרקי7,9,29 מראה דמיון מסקרן לממצאים שלנו. מחקרים קודמים על ניוון IVD כבר תיארו היווצרות אשכול כסימן היכר של ניוון דיסק14,30,31,32,33. מאז אשכולות אלה ניתן למצוא בעיקר ברקמות מנוונות מאוד, היווצרות אשכול עשוי להצביע על ניסיון כושל של הרקמה כדי לתקן את הנזק הניווני34. יצירת מתאם חזק בין דפוס chondrocyte השולט המקומי לבין גמישות רקמות, רלוונטיות תפקודית גבוהה של דפוסים אלה ניתן להדגים סחוס מפרקי10,11. ניתן לשער כי רלוונטיות תפקודית כזו חלה גם על ארגון כונדרוציטים מרחבי בעירוי.
ניתוחים היסטולוגיים פלואורסצנטיים הם אמצעי קל להשגה ואטרקטיביים לניתוח שינויים מורפולוגיים ברקמות. כאשר מנסים לנתח היסתולוגית את ההפריה ה-IVD, ישנם קשיים טכניים ברורים שיש להתגבר עליהם: ראשית, הזמינות המוגבלת של הרקמה האנושית מקשה על בחירת אורגניזם מודל בעלי חיים הולם שבו ניתן לחקור היבטים אלה של המחלה שבה לא ניתן להשיג דגימות אנושיות. לשאלת המחקר המוזכרת במחקר זה, בחרנו במודל של חיות בקר.
שנית, עיבוד של סוג קולגן I עשיר IVD הוא הרבה יותר מאתגר מאשר עבור רוב הרקמות האנושיות האחרות. רשת הסיבים I של קולגן צפופה מפזרת בחוזקה את האור הפלואורסצ'ית ויוצרת אות רעשי רקע גבוה. בעיה זו מטופלת בצורה הטובה ביותר באמצעות טכניקה המאפשרת חיסור או חיסול של אות רקע כזה. שיטה ידועה לעשות זאת היא מיקרוסקופיה קונפוקלית. בעוד שאיכות התמונה של תמונות לייזר שנרכשו קונפוקליות היא בדרך כלל מצוינת, החסרונות של טכניקה זו הם שהיא גוזלת זמן רב יחסית וככזו היא אינה מאפשרת ניתוח של אזורי רקמות גדולים יותר באמצעות הדמיית פסיפס. שנית, מיקרוסקופים קונפוקליים יקרים יחסית ואינם זמינים בכל מקום. דרך מהירה וזולה הרבה יותר לסנן רעשי רקע היא לבצע חתך אופטי למשל, באמצעות אפוטום.
כדי להיות מסוגל לפרש נכון את הממצאים, זה חיוני גם להקצות כראוי את הרקמה כי יש לנתח למקור שלה IVD. בעוד משימה זו היא פשוטה יחסית כאשר יש דיסק בקר שלם לבחירה, זה יכול להיות מאתגר מאוד בעת קבלת רקמה אנושית מתיאטרון המבצע. המאפיין האופייני של סינולוס סיבי הוא סוג הקולגן הצפוף מאוד שלו אני רשת בכיוון סיבי זווית רובדים. הגרעין, לעומת זאת, הוא מבנה ג'לטיני אמורפי שבו אין ארכיטקטורת קולגן גבוהה יותר הנראית לעין בלתי. אזור הביניים נמצא בין שני האקסטרמה האלה ויש לו גם ארכיטקטורת סיבי קולגן ברורה, אך הוא רך בהרבה וצפוף פחות מהסיבי אנולוס. לוחית הקצה הקרטילגית מורכבת סחוס היאלין, אינה מציגה ארכיטקטורת קולגן המוכרת בעין בלתי, אך היא די דמוית זכוכית כפי שהמונח היאלין מציע. שלא כמו גרעין pulposus זה, עם זאת, גם נוקשה מאוד, לא ניתן לעוות, והוא ממוקם על העצם התת-ביתית אשר לעתים קרובות עדיין ניתן לזהות על ידי בדיקה של הרקמה.
לאחר שמקור הרקמה זוהה כראוי, הרקמה עדיין צריכה להיות מכוונת כראוי לחתך כדי לקבל תמונות סטנדרטיות המאפשרות גם קריאה איכותית וכמותית נכונה. בכיוון לטכניקות הדמיה אחרות כגון הדמיית תהודה מגנטית אנו מציעים שני מישורי ניתוח סטנדרטיים: מקטע חציוני-קשתי אחד ואחד במישור צירי. שני מטוסים אלה יספקו גם רושם טוב על הארכיטקטורה של רשת הסיבים I מסוג קולגן של האנלוס. כאשר מפרשים את הממצאים שהתקבלו מכתים F-actin יש לזכור כי הקפאת דגימות הרקמה עלולה לגרום לשינויים במבנה הציטוסד35 אשר, עם זאת, לא צריך להשפיע על ארגון chondrocyte מרחבי.
כדי להבין באופן מלא את הביולוגיה התאית של IVD הוא אחד האתגרים הפתוחים עדיין בהבנתנו של ניוון דיסק והתחדשות36. שאלות שנראות לעתים טריוויאליות, כגון הסידור הפיזיולוגי של תאים ברקמה בריאה או שאלת הארגון מחדש של התאים במהלך ניוון, נותרות, עד כה, ללא מענה. הידע המתקבל עשוי לאפשר לנו להשתמש בסמן ניוון מבוסס תמונה זה כדי להעריך את איכות הרקמה, לחקור את הפיכות היווצרות אשכול ובכך אולי להגדיר חלון טיפולי שבו התהליכים המנוונים עדיין יכולים להיות ממוקדים בהצלחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למחברים השותפים שלנו מהפרסומים המקוריים על עזרתם ותמיכתם. אנו מודים לשרלוט אמה במברגר על שעזרה להשיג את תמונות האפוטום.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Merck KGaA, Germany | A2942 | |
| Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, Germany | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | ||
| CellMask Actin Tracking Stain | Thermo Fischer Scientific, US | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, US | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, US | D1306 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco, Life Technologies, Germany | 41966052 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich, US | 60004 | |
| Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | 3834000604 | |
| Formaldehyde | Merck KGaA, Germany | 104002 | |
| Image J 1.53a, with Cell counter plugin | National Insittute of Health (NIH), US | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, US | A12380 | |
| Microscopic Cover Glasses | R. Langenbrinck, Germany | 01-1818/1 | |
| PAP Pen Liquid Blocker | Science Sevices GmbH, Germany | N71310 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich, US | P4333 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,US | P5119 | |
| Scalpel | pf medical AG, Germany | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Netherlands | SA6255012 |
References
- Urban, J. P. G., Roberts, S.
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N.
- Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
- Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
- Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
- Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
- Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
- Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
- Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
- Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
- Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
- Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
- Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, Suppl 1 10 (2012).
- Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
- Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
- Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), Phila Pa. 755-762 (1999).
- Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), Phila Pa. 2793-2799 (2004).
- Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
- Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), Phila Pa. 1873-1878 (2001).
- Habermehl, K. H. Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , Paul Parey. Berlin, Hamburg. (1975).
- Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
- Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
- Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
- Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
- Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
- Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
- Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
- Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, Pt 4 680-682 (2007).
- Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, Pt 6 864-869 (2002).
- Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
- Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
- Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), Oxford. 5-10 (2009).
- Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
- McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).
