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Biology

भ्रूण विकास से अध: पतन तक इंटरवर्टेब्रल डिस्क का ऑप्टिकल सेक्शनिंग और विज़ुअलाइज़ेशन

Published: July 8, 2021 doi: 10.3791/62594
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4, 5, 2, 1,2, 1
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 2Department of Orthopedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 3Institute for Bioinformatics and Medical Informatics, Faculty of science of the University of Tübingen, 4Medical faculty of the University of Tübingen, 5Bavarian Health and Food Safety Authority

Summary

हम एक ऑप्टिकल सेक्शनिंग विधि का उपयोग करके इंटरवर्टेब्रल डिस्क के एनुलस फाइब्रोसस में स्थानिक कॉन्ड्रोसाइट संगठन की जांच करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) डिजनरेशन कम पीठ दर्द का एक प्रमुख कारण है और यह प्रभावित व्यक्तियों के लिए उच्च स्तर की हानि पर जोर देता है। डिस्क अध: पतन को डिकोड करने और पुनर्योजी दृष्टिकोण विकसित करने में सक्षम होने के लिए आईवीडी के सेलुलर जीव विज्ञान की पूरी तरह से समझ आवश्यक है। इस जीव विज्ञान का एक पहलू जो अभी भी अनुत्तरित है, यह सवाल है कि कोशिकाओं को शारीरिक स्थिति में और पतन के दौरान कैसे व्यवस्थित किया जाता है। आईवीडी के जैविक गुण और इसकी उपलब्धता इस ऊतक का विश्लेषण करने में मुश्किल बनाती है। वर्तमान अध्ययन प्रारंभिक भ्रूणीय विकास से अंत चरण पतन के लिए एनुलस फाइब्रोसस में स्थानिक chondrocyte संगठन की जांच करता है । एक ऑप्टिकल सेक्शनिंग विधि (Apotome) एक पशु मॉडल और मानव डिस्क रीढ़ की सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त ऊतक के रूप में गोजातीय भ्रूण ऊतक का उपयोग कर उच्च संकल्प धुंधला विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए लागू किया जाता है । प्रारंभिक भ्रूणीय गोजातीय डिस्क में बहुत अधिक कोन्ड्रोसाइट घनत्व से, गर्भ, विकास और परिपक्वता के दौरान कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है। मानव डिस्क में, सेलुलर घनत्व में वृद्धि ऊतक पतन की प्रगति के साथ हुई। जैसा कि पहले से ही आर्टिकुलर कार्टिलेज में प्रदर्शित किया जा चुका था, क्लस्टर गठन उन्नत डिस्क अध: पतन की एक विशेषता विशेषता का प्रतिनिधित्व करता है।

Introduction

इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) एक उपास्थि-आधारित संरचना है जो जैव रासायनिक रूप से और सेलुलर वास्तुकला के संबंध में, पहली नजर में, आर्टिकुलर कार्टिलेज1कई मायनों में जैसा दिखता है। दरअसल, आर्टिकुलर कार्टिलेज के आईवीडी डिजनरेशन और ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) दोनों को उपास्थि पहनने, सबकॉन्ड्रल सिस्ट और ऑस्टियोफाइट गठन, और सबकॉन्ड्रल स्क्लेरोसिस2,3के कारण संयुक्त अंतरिक्ष संकुचन की विशेषता है। इन प्रतीत समानताएं वास्तुकला और दोनों ऊतकों की कार्यात्मक भूमिका के बावजूद अलग है। जबकि आर्टिकुलर कार्टिलेज का मैट्रिक्स मुख्य रूप से आर्केड-बनाने वाले कोलेजन प्रकार II नेटवर्क से बनता है, आईवीडी में तीन अलग-अलग प्रकार के ऊतक होते हैं: केंद्र में कोलेजन प्रकार II-समृद्ध नाभिक लुगूपस अक्षीय भार लेता है और उन्हें घनी पैक परिपत्र कोलेजन प्रकार I फाइबर की एक शामिल अंगूठी में पहुंचाता है जिसे एनुलस रेशे कहा जाता है। उनका कार्य प्रोटेओग्लिकैन द्वारा प्राप्त अनुवादित अक्षीय दबावों को अवशोषित करना है- और पानी से भरपूर नाभिक उनके तन्य देशांतर फाइबर ताकत के साथ। प्रत्येक नाभिक के ऊपर और नीचे और एक हाइलिन कार्टिलाजिनस एंडप्लेट एक हाइलाइन कार्टिब्रेस एंडप्लेट आसन्न कशेरुकी4 (चित्रा 1) के लिए जंक्शनबनाता है।

आर्टिकुलर कार्टिलेज में, चार अलग-अलग स्थानिक कॉन्ड्रोसाइट पैटर्न पाए जा सकते हैं: जोड़े, तार, डबल तार, छोटे क्रमशः बड़े समूह5,6,7 (चित्रा 2)। इस पैटर्न में परिवर्तन ओए की शुरुआत और प्रगति 8,9से जुड़ेहुएहैं । स्थानिक chondrocyte संगठन भी उपास्थि की एक प्रत्यक्ष कार्यात्मक संपत्ति के लिए संकेत है, अर्थात् अपनी कठोरता, इस छवि आधारित ग्रेडिंग दृष्टिकोण10, 11की कार्यात्मक प्रासंगिकता को रेखांकित करता है । इन पैटर्नों को इसके अतिरिक्त पहले से मौजूद चिकित्सकीय रूप से उपलब्ध प्रौद्योगिकी12के साथ पहचाना जा सकता है । आईवीडी और आर्टिकुलर कार्टिलेज के बीच समानताओं के कारण, यह परिकल्पना की जा सकती है कि आईवीडी में विशेषता कॉन्ड्रोसाइट पैटर्न भी मौजूद हैं। क्लस्टर गठन एक ऐसी घटना है जो डीरेज आईवीडी13,14में भी देखी गई है .

आईवीडी में स्थानिक सेलुलर संगठन का विश्लेषण करने की कोशिश करते समय, आर्टिकुलर कार्टिलेज की जांच करते समय मौजूद नहीं कई तकनीकी कठिनाइयों को दूर करना आवश्यक है:

सबसे पहले, ऊतक का प्रसंस्करण सजातीय हाइलाइन उपास्थि के साथ की तुलना में बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण है जो काफी हद तक कोलेजन प्रकार II से बना है। आईवीडी का मुख्य फाइबर घटक कोलेजन प्रकार I है, जो पतले हिस्टोलॉजिक वर्गों को उत्पन्न करना अधिक कठिन बनाता है। जबकि हाइलाइन आर्टिकुलर उपास्थि में भी ऊतक की "ग्लास-जैसे" प्रकृति के कारण आसानी से मोटी धाराओं का विश्लेषण किया जा सकता है, आईवीडी का कोलेजन प्रकार I नेटवर्क ऑप्टिकल रूप से अत्यधिक अभेद्य है। इस कारण से, आईवीडी के हिस्ट्रोलॉजी में एक मजबूत पृष्ठभूमि शोर एक आम समस्या है। इस ऑप्टिकल घने ऊतक में प्रवेश करने का एक तेज और सस्ता तरीका एक ऑप्टिकल सेक्शनिंग डिवाइस का उपयोग है जैसे, एक Apotome के माध्यम से। ऐसे में एक Apotome, एक ग्रिड एक पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के रोशनी मार्ग में डाला जाता है। ग्रिड के सामने एक विमान के समानांतर कांच की प्लेट रखी गई है। यह आगे और पीछे झुकाव इस प्रकार तीन अलग-अलग पदों में छवि में ग्रिड पेश करता है। प्रत्येक जेड-स्थिति के लिए, अनुमानित ग्रिड के साथ तीन कच्चे चित्र बनाए जाते हैं और आरोपित होते हैं। विशेष सॉफ्टवेयर के माध्यम से, आउट ऑफ फोकस लाइट की गणना की जा सकती है। अंतर्निहित सिद्धांत यह है कि, यदि ग्रिड दिखाई दे रहा है, तो वह जानकारी ध्यान में है, यदि इसे ध्यान से बाहर माना जाता है । इस तकनीक के साथ, अच्छी तरह से केंद्रित और उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को उचित समय में प्राप्त किया जा सकता है।

दूसरे, ऊतक मानव दाताओं से आने के लिए मुश्किल है । कुल घुटने प्रतिस्थापन करते समय, सर्जरी के दौरान आगे के विश्लेषण के लिए संयुक्त की पूरी सतह प्राप्त की जा सकती है। यद्यपि एक डायाथ्रोडायल संयुक्त का ऑस्टियोआर्थराइटिस भी पूरे संयुक्त की बीमारी है, फिर भी उपास्थि की गुणवत्ता में मजबूत केंद्र अंतर हैं, आमतौर पर संयुक्त के कुछ क्षेत्र अभी भी बरकरार हैं, उदाहरण के लिए उस क्षेत्र में कम लोडिंग के कारण। यह स्थिति आईवीडी में अलग है, जहां सर्जरी आमतौर पर केवल तब की जाती है जब डिस्क विश्व स्तर पर नष्ट हो जाती है। ऑपरेशन कक्ष से मानव दाताओं से ऊतक प्राप्त करते समय, ऊतक भी अत्यधिक खंडित होता है और आगे विश्लेषण करने से पहले आईवीडी के तीन उपास्थि प्रकारों में से एक को ऊतक को सही ढंग से आवंटित करना आवश्यक है। यह भी बड़ा ऊतक वर्गों के अधिक विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देने के लिए और आईवीडी के भ्रूणीय विकास की जांच करने के लिए एक पशु मॉडल जीव की पसंद, इसलिए, आवश्यक है ।

इस तरह के मॉडल जीव का चयन करते समय एक ऐसी प्रणाली होना महत्वपूर्ण है जो मानव डिस्क के साथ इसके शरीर रचना और आयामों, इसकी यांत्रिक लोडिंग, वर्तमान कोशिका आबादी के साथ-साथ इसकी ऊतक संरचना के संबंध में तुलनीय हो। प्रस्तुत तकनीक के उद्देश्य के लिए यहां हम गोजातीय काठ डिस्क ऊतक के उपयोग का सुझाव देते हैं: मानव डिस्क की एक महत्वपूर्ण संपत्ति जिसके परिणामस्वरूप इसकी कम पुनर्योजी क्षमता नाभिक में परिपक्वता के दौरान नोटोऑर्डल कोशिकाओं का नुकसान होता है। हालांकि, कई मॉडल जीवों में नोटोऑर्डल कोशिकाओं को उनके पूरे जीवन भर का पता लगाया जा सकता है। कुछ जानवरों में से अधिकांश जो भेड़, बकरी या chondrodystrophig कुत्तों के रूप में अपने नोटोकॉर्डल कोशिकाओं को खो देते हैं, एक आईवीडी है जो मानव डिस्क की तुलना में बहुत छोटा है। केवल काठ गोजातीय डिस्क मानव आईवीडी15के लिए एक तुलनीय सगितिटल डिस्क व्यास के साथ मौजूद है ।

प्रारंभिक डिस्क अध: पतन के लिए अग्रणी एक प्रमुख कारक अत्यधिक यांत्रिक लोडिंग है। काठ की रीढ़ की हड्डी में खड़ी गाय का इंट्राडिस्कल दबाव क्षैतिज रूप से गठबंधन रीढ़ के साथ लगभग 0.8 MPa है। आश्चर्यजनक रूप से ये दबाव काठ के इंट्राडिस्कल दबावों से तुलनीय हैं जो मानव रीढ़ (0.5 एमपीए)15, 16के लिए सूचित किए गए हैं। इसके अलावा गोजातीय डिस्क में पानी और प्रोटेओग्लाइकन की मात्रा युवामनुष्योंसे आईवीडी की तुलना में है । इसलिए, यद्यपि गति खंडों का वास्तविक आंदोलन पैटर्न द्विपदीय मानव से चौगुनी जानवरों में भिन्न हो सकता है, कुल लोडिंग और डिस्क विशेषताओं के संबंध में, गाय भेड़ और कुत्तों जैसे आईवीडी के लिए अन्य स्थापित पशु मॉडलों की तुलना में मानव जीव विज्ञान के बहुत करीब है।

इस प्रोटोकॉल में हम एक तकनीक पेश करते हैं कि प्रारंभिक भ्रूणीय विकास से लेकर चरण अध: पतन तक स्थानिक chondrocyte संगठन के दृष्टिकोण से आईवीडी में परिवर्तनों का विश्लेषण कैसे किया जाए।

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Protocol

भ्रूणीय विकास और परिपक्वता के विश्लेषण के लिए, गोजातीय डिस्क का उपयोग किया गया था। आईवीडी के पतन का मूल्यांकन करने के लिए, मानव नमूनों का विश्लेषण किया गया ।

मानव आईवीडी ऊतक काठ डिस्क पतन, डिस्क प्रोलैप्स, या हड्डी रोग सर्जरी विभाग में रीढ़ की हड्डी आघात, Tübingen के विश्वविद्यालय अस्पताल और बीजी ट्रामा सेंटर Tübingen के लिए सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त किया गया था । अध्ययन शुरू होने से पहले पूर्ण नैतिक समिति की मंजूरी प्राप्त की गई थी (परियोजना संख्या 244/2013BO2)। भाग लेने से पहले सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त हुई थी । विधियों को अनुमोदित दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया ।

गोजातीय ऊतक स्वास्थ्य और खाद्य सुरक्षा के लिए बवेरियन राज्य कार्यालय से प्राप्त किया गया था/ मृत जानवरों से ऊतक के लिए स्थानीय और पशु चिकित्सा अधिकारियों की मंजूरी प्राप्त हुई थी ।

1. नमूना फसल

  1. मानव आईवीडी ऊतक: दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में 2% (v/v) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ तुरंत प्राप्त आईवीडी नमूनों को रखें और आगे की प्रक्रिया तक 4 सी पर (v/v) एम्फोटेट्रीकिन बी स्टोर का 1.2% रखें। 48 घंटे के भीतर ऊतक की प्रक्रिया। वैकल्पिक रूप से, ऊतकों को -20 डिग्री सेल्सियस पर कई हफ्तों तक स्टोर करें।
  2. गोजातीय आईवीडी ऊतक: मृत्यु के बाद 24 घंटे के भीतर जानवरों से ऊतक की कटाई करना सुनिश्चित करें।
    मृत जानवरों एन-ब्लॉक से आसपास के कशेरुकी के साथ गोजातीय डिस्क को फिर से काटें। सूखी बर्फ पर जमे हुए ऊतकों को परिवहन करें और आगे की प्रक्रिया तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: यदि केवल फ्लोरेसेंस विश्लेषण का इरादा है और एलिसा या पीसीआर जैसे जैव रासायनिक मात्राकरण विधियों की योजना नहीं बनाई गई है, तो ऊतक निर्धारण करें जैसा कि नीचे बताया गया है। यह ऊतक को संसाधित करने की आवश्यकता से पहले भंडारण में लंबे समय तक रखने की अनुमति देता है। ऊतक मैट्रिक्स की गिरावट को रोकने के लिए, फसल के बाद 48 घंटे के भीतर निर्धारण करें जब तक कि ऊतक सीधे जमे हुए न हो।

2. नमूना तैयार करना

  1. कमरे के तापमान पर जमे हुए ऊतकों को गल लें। ऊतक को जैसे ही कोई बर्फ-क्रिस्टल ऊतक के डिजिटल कोमल संपीड़न पर महसूस नहीं किया जा सकता है।
    नोट: पेट्री डिश में डीएमईएम में ऊतक की तैयारी करें।
  2. कोलेजन घनत्व और अभिविन्यास जैसे स्थूल गुणों के आधार पर मानव आईवीडी ऊतक (एनुलस फाइब्रोसस, इंटरमीडिएट जोन, न्यूक्लियस पल्पोसस, या कार्टिलाजिनस एंडप्लेट) की उत्पत्ति की पहचान करें।
  3. अपने दो आसन्न कशेरुकी के साथ गोजातीय आईवीडी डिस्क से मिलकर मोशन सेगमेंट लें और सर्जिकल ब्लेड (ब्लेड नंबर 15) का उपयोग करके सबकॉन्ड्रल बोन से डिस्क को पूरी तरह से विच्छेदन करें।
    1. अधिक केंद्रित क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए डिस्क फ्लिप करने के लिए दो शारीरिक संदंश का उपयोग करें। विच्छेदन करें। नाभिक लुगूलोसस को अंतिम रूप से पुनः प्राप्त करना सुनिश्चित करें क्योंकि यह एनुलस की तुलना में बहुत पतला है, जो आंसू से ग्रस्त है, और यह आसानी से परिभाषित फैशन में नहीं आता है।
    2. उपास्थि के विभिन्न क्षेत्रों की पहचान करें।
    3. सर्जिकल ब्लेड (ब्लेड संख्या 20 या 22) का उपयोग करके पूरे डिस्क से ब्याज के क्षेत्र को काट दें। वैकल्पिक रूप से, क्रायोटोम ब्लेड का उपयोग करें।
      नोट: के रूप में गोजातीय डिस्क रीढ़ की हड्डी के एक भाग के रूप में एन ब्लॉक आते हैं, डिस्क में तैयार किया जा सकता है toto । यह विभिन्न प्रकार के उपास्थि की सही पहचान को बहुत आसान बनाता है। ऊपर वर्णित फैशन में डिस्क को विच्छेदन करते समय, कार्टिलाजिनस एंडप्लेट कशेरुकी पर रहता है। यदि इस क्षेत्र की जांच की जाएगी, तो यह थोड़ा झुका हुआ स्पर्शरेखा दिशा में काम करने वाले छेनी के साथ अंतर्निहित हड्डी से सबसे अच्छा लिया जाता है।
  4. यदि भ्रूण 20 सेमी से छोटे की मुकुट-दुम लंबाई के होते हैं, तो आईवीडी के ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करने के लिए टोटो में भ्रूण को संसाधित करना सुनिश्चित करें। इन मामलों में कशेरुकी का कोई विच्छेदन न करें।
  5. एक बार डिस्क में फिर से काट दिया गया है toto, उपास्थि के विभिन्न क्षेत्रों की पहचान।
    1. कमरे के तापमान पर एथिलेंडिमीनेट्रैक्टेटिक एसिड (EDTA) (20% (w/v); पीएच = 7.4) में डिक्लेक्टिफिकेशन करें। नमूना आकार के आधार पर मात्रा चुनें - पूरे ऊतक को ईडीटीए के साथ अच्छी तरह से कवर किया जाना चाहिए।
    2. दैनिक रूप से डिक्लेक्टिफिकेशन समाधान बदलें जो ऊतक के आकार के आधार पर 5 दिनों तक जा सकता है।
    3. सत्यापित करें कि डिकलिफिकेशन 20 गेज सुई के साथ सफल है जो उल्लेखनीय प्रतिरोध के बिना कशेरुकी में प्रवेश करता है।
      नोट: प्रतिक्रिया प्रभावता बनाए रखने के लिए चेलेट बाइंडर ईडीटीए को संतृप्ति से रोकने के लिए डिक्लेयरिफिकेशन समाधान का दैनिक परिवर्तन महत्वपूर्ण है। यह बैक्टीरियल कॉलोनाइजेशन को भी रोकता है।

3. नमूना आयु, अखंडता, और पतन की ग्रेडिंग

  1. नैदानिक जानकारी के साथ-साथ एक्स-रे और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग18 (चित्रा 3)की मदद से मानव डिस्क ऊतक को निम्नलिखित श्रेणियों में से एक में वर्गीकृत करें।
    नोट: श्रेणी I: तीव्र रीढ़ की हड्डी के आघात से प्राप्त आईवीडी अध: पतन के किसी भी रेडियोलॉजिकल संकेत के बिना निकट स्वस्थ नमूना उपयोग एनुलस के रूप में सेवा करने के लिए।
    श्रेणी II: शुरुआत के साथ तीव्र सूजन की स्थिति को समझाने के लिए 4 सप्ताह से कम की अवधि के साथ नैदानिक लक्षणों वाले रोगियों से मध्यवर्ती क्षेत्र से ऊतक का उपयोग करें।
    श्रेणी III: एक ऐसी स्थिति का वर्णन करने के लिए जहां भड़काऊ प्रतिक्रिया पहले से ही ऊतक को प्रभावित करने का समय था और कोशिकाओं को उन रोगियों से ऊतक लेना पड़ता है जो परमाणु पतन के लिए संचालित थे लेकिन 4 सप्ताह से अधिक लक्षण अवधि के साथ।
    श्रेणी IV: मध्यम डिस्क डिजनरेशन के लिए चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग19में 3 या 4 के फीरमैन स्कोर के साथ अपक्षयी डिस्क रोग के लिए इंटरबॉडी फ्यूजन के साथ सर्जरी से प्राप्त एनुलस का चयन करें।
    श्रेणी V: अंत चरण पतन प्रक्रिया के लिए 5 के फीमरमैन स्कोर के साथ अपक्षयी डिस्क रोग के लिए इंटरबॉडी फ्यूजन के साथ सर्जरी से प्राप्त एनुलस।
  2. जानवर के विकास स्तर/आयु के आधार पर गोजातीय ऊतक को आठ श्रेणियों में से एक में वर्गीकृत करें, जैसा कि तालिका 1में प्रदर्शित किया गया है ।
    1. केलर द्वारा सुझाए गए सूत्र के आधार पर भ्रूण की क्राउन-दुम लंबाई पर गर्भकाल की गणना करें:
      महीनों में गर्भावस्था की उम्र = Equation 1
      नोट: गर्भ के पहले 4 हफ्तों में पशु 0.8-2.2 सेमी20की एक मुकुट दुम लंबाई के साथ मौजूद हैं ।

4. ऊतक निर्धारण

  1. 10x में नमूनों को उतारें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 4% (w/v) फॉर्मलडिहाइड समाधान के नमूने की मात्रा ।
    नोट: फॉर्मलडिहाइड समाधान प्रत्येक दिशा से लगभग 1 मिमी/घंटे की दर से ऊतक में प्रवेश करता है। बहुत छोटे या बहुत बड़े नमूनों के लिए जोखिम समय का समायोजन आवश्यक हो सकता है।
  2. आगे की प्रोसेसिंग तक टिश्यू को पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. हिस्टोलॉजिक सेक्शनिंग

  1. क्रायोटोम नॉब पर पानी में घुलनशील एम्बेडिंग माध्यम में नमूनों को एम्बेड करें।
    1. ऊतक को घुंडी पर रखें ताकि या तो एक अक्षीय विमान उत्पन्न हो या एक विमान जो कोलेजन प्रकार I lamellae लंबवत (उदाहरण के लिए, एक औसत धनु खंडित विमान) में कटौती करता है।
      नोट: ऊतक को एम्बेडिंग माध्यम द्वारा पूरी तरह से कवर किया जाना चाहिए।
  2. मानव नमूनों में 70 माइक्रोन की मोटाई पर एम्बेडेड ऊतक को अनुभाग करें और एक मानक क्रायोटोम का उपयोग करके गोजातीय नमूनों में 40 माइक्रोन करें।
    नोट: अनुभाग मोटाई में अंतर बरकरार गोजातीय डिस्क और अत्यधिक पतित मानव ऊतक के बीच ऊतक अखंडता में अंतर के कारण है ।
  3. एक गिलास स्लाइड पर वर्गों को ले लीजिए।
    1. एक हाइड्रोफोबिक पेन के साथ ऊतक वर्गों को घेरना।
    2. पानी में घुलनशील एम्बेडिंग माध्यम को हटाने के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ 3 बार वर्गों कुल्ला।

6. फ्लोरेसेंस धुंधला

  1. पीबीएस में डीएपीआई (एक्समैक्स 358 एनएम, एमेक्स 461 एनएम) के 60 माइक्रोन के साथ-साथ ऐक्टिन ट्रैकिंग स्टेनिंग (एक्समैक्स 540 एनएम, एमेक्स 565 एनएम) के 1% (v/v) को जोड़ा जाए और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाए।
    नोट: यहां वर्णित धुंधला प्रोटोकॉल ACTIN ट्रैकिंग दाग (लाल) का उपयोग करके DAPI परमाणु धुंधला (नीला) और साइटोप्लाज्म का उपयोग करके नाभिक की कल्पना करना है। आईवीडी में ग्रीन चैनल में कोलेजन फाइबर के कारण एक मजबूत ऑटोफ्लोरेसेंस है। इस प्रोटोकॉल में वर्गों में जोड़े गए तरल पदार्थ की मात्रा लगभग 5 मिमी x 5 मिमी के आकार के वर्गों के लिए है। बड़े वर्गों के लिए इस राशि को तदनुसार बढ़ाने की जरूरत है। डाई को ब्लीचिंग से रोकने के लिए सीधे सूरज की रोशनी के संपर्क के बिना और मंद रोशनी के साथ कमरे में सभी कार्यों का प्रदर्शन करें।
  2. एक पिपेट के साथ धुंधला तरल पदार्थ निकालें और हर बार पीबीएस के 60 माइक्रोन के साथ तीन बार धोएं।
  3. एक उपयुक्त बढ़ते माध्यम जोड़ें और एक कवर पर्ची के साथ वर्गों को कवर।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कवर स्लिप जोड़ते समय कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं। यह सबसे अच्छा एक रिम पर स्लाइड के साथ पर्ची का संपर्क शुरू करने और फिर पर्ची धीरे से नीचे आने से किया जाता है ।

7. माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग और प्रोसेसिंग

  1. माइक्रोस्कोप के नमूना धारक पर एक दाग अनुभाग के साथ एक स्लाइड रखें।
    नोट: आईवीडी के घने कोलेजन प्रकार I नेटवर्क के कारण, बिखरे हुए प्रकाश से ऊतक को पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना करना मुश्किल हो जाता है। इस समस्या को दूर करने का एक तरीका संरचित रोशनी का उपयोग करके ऑप्टिकल सेक्शनिंग करना है। यह दोनों चैनलों (नीले और लाल) में पूरे नमूने का त्रि-आयामी प्रक्षेपण प्रदान करने की अनुमति देता है। यह नमूना के साथ-साथ व्यक्तिगत पैटर्न के 3 डी पुनर्निर्माण का अवलोकन प्राप्त करने के लिए 10x आवर्धन उद्देश्य लेंस के साथ संरचित रोशनी सेटिंग और मोज़ेक-मोड का उपयोग करके सबसे अच्छा किया जाता है।
  2. संरचित रोशनी डिवाइस शुरू करें।
    1. एक उपयुक्त फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप, फ्लोरेसेंस फिल्टर और पर्याप्त रोशनी के साथ एकल क्षेत्र के दृश्य इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: इमेजिंग अधिग्रहण को मानकीकृत करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी फ़िल्टर के लिए एक्सपोजर समय को समायोजित करें। उच्च संकल्प छवि पर नमूने का सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए उच्च आवर्धन (उदाहरण के लिए, 20x उद्देश्य) वाले अनुभाग।
    2. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ संगत छवि अनुकूलन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके तीव्रता और चमक को अनुकूलित करके चित्रों को पोस्टप्रोसेस करता है।
  3. मोज़ेक इमेजिंग तकनीक का पूरा उपयोग करने के रूप में अनुभाग की कल्पना करने के लिए
    1. टूलबार पैनल से अधिग्रहण सेटिंग्स (6D-अधिग्रहणपर प्रेस) खोलें।
    2. मोज़ेक सेटिंग्स (MosaiX रजिस्टरमें) को समायोजित करें और फील्ड-ऑफ-व्यू छवियों के स्तंभों और पंक्तियों की संख्या को परिभाषित करें जिन्हें बाद में एक अवलोकन छवि में विलय कर दिया जाएगा।
    3. सेटअप दबाएं और व्यक्तिगत टाइल्स के फोकस सुधार को समायोजित करें।
      नोट: एक बड़े ऊतक अनुभाग के लिए एक ही फोकस विमान में पूरे ऊतक सतह होना लगभग असंभव है। विभिन्न फोकल स्तरों पर इमेज टाइल्स 'मोसैएक्स अधिग्रहण' द्वारा ली जा सकती हैं।
    4. छवि टाइल्स के अधिग्रहण शुरू करने के लिए, प्रेस शुरू करते हैं।
    5. सॉफ्टवेयर में शामिल 20% ओवरलैप के साथ सिलाई फ़ंक्शन(सिलाई बटन) का उपयोग करके इमेज्ड टाइल्स को सिलाई करें।
    6. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ संगत छवि अनुकूलन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके तीव्रता और चमक को अनुकूलित करके चित्रों को पोस्टप्रोसेस करता है।
  4. स्थानिक chondrocyte संगठन का विश्लेषण करने के लिए, सॉफ्टवेयर में शामिल 3 डी समारोह का उपयोग करें ।
    1. जेड-स्टैक सेटिंग्स को एडजस्ट करें। स्कैनिंग मापदंडों को परिभाषित करें: स्टार्ट/स्टॉप बटन को सक्रिय करके जेड-एक्सिस और स्लाइस दूरी में स्टार्ट और स्टॉप पोजिशन को परिभाषित करें।
      नोट: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से स्लाइस की संख्या की गणना करता है।
    2. छवि जेड-स्टैक का अधिग्रहण शुरू करने के लिए, प्रेस स्टार्ट।
    3. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ संगत छवि अनुकूलन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके तीव्रता और चमक को अनुकूलित करके चित्रों को पोस्टप्रोसेस करता है।
  5. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ संगत फ़ाइल प्रारूप के साथ चित्रों का निर्यात करें।
    नोट: 3डी पुनर्निर्माण को व्यक्तिगत छवियों के रूप में निर्यात करें या/और इंटरैक्टिव 3D मॉडल के रूप में या वीडियो प्रारूप में ।

8. सेलुलर पैटर्न पहचान और घनत्व मूल्यांकन

  1. एक उपयुक्त छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम में पूरे ऊतक अनुभाग के निर्यात मोज़ेक चित्रों को खोलें।
  2. चित्रों में 500 माइक्रोन x 500 माइक्रोन के हित के क्षेत्रों को परिभाषित करके सेल घनत्व मूल्यांकन के अधीन क्षेत्रों को परिभाषित करें।
    नोट: जिन टाइल्स में पर्याप्त छवि गुणवत्ता नहीं है, उन्हें विश्लेषण से बाहर रखा गया है।
  3. व्यक्तिगत सेलुलर पैटर्न की पहचान करें।
    नोट: एकल कोशिकाओं को व्यक्तिगत कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया जाता है - आसन्न मैट्रिक्स के भीतर पूरी तरह से समझाया जाता है। जोड़े को निकटता (<25 माइक्रोन) में दो आसन्न कोशिकाओं के रूप में परिभाषित किया जाता है जिससे कोशिकाओं को उनके मैट्रिक्स के माध्यम से आपस में जोड़ा जाता है (चित्र 2देखें)। स्ट्रिंग-फॉर्मेशन कम से कम तीन कॉन्ड्रोसाइट्स लाइन में गठबंधन (नाभिक <25 माइक्रोन के बीच से) हैं। इन कोशिकाओं को एक अक्षुण्ण मैट्रिक्स द्वारा शामिल किया जाता है और मैट्रिक्स इंटरकनेक्शन प्रत्येक कोशिका के बीच देखा जा सकता है। क्लस्टर कई कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं जो एक दूसरे (<25 माइक्रोन) के सीधे निकटता में स्थित हैं और मैट्रिक्स से रहित एक बड़ी कमी में समझाया जाता है।
  4. सेलुलर पैटर्न के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सेल काउंट प्लग-इन का उपयोग करें।
    नोट: साइटोप्लाज्म धुंधला विभिन्न स्थानिक पैटर्न की पहचान करने के लिए एक सत्यापन विधि का प्रतिनिधित्व करता है।
  5. ब्याज के चुने हुए क्षेत्र के आकार से गिना कोशिकाओं को विभाजित करके सेल घनत्व की गणना करें।

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Representative Results

मोज़ेक छवियों का उपयोग करना, एनुलस और नरम नाभिक में अपने घने कोलेजन फाइबर नेटवर्क के साथ आईवीडी की वास्तुकला को स्पष्ट रूप से पहचाना जासकता है (चित्र 4)। भ्रूणीय विकास(चित्रा 5)के दौरान सेलुलर घनत्व में निरंतर कमी देखी जा सकती है। जबकि आईवीडी विकास के शुरुआती दौर में गोजातीय एनुलस फाइब्रोसस में 11,435 कोशिकाओं/एमएम² का कोशिका घनत्व और गोजातीय नाभिक पल्पोसस में 17,426 कोशिकाएं/एमएम ² पाया जा सकता है, ये संख्या जन्म तक १,०११ कोशिकाओं/एमएम ² (गोजातीय एनुलस फाइब्रोसस) और ४८८ कोशिकाओं/एमएम² (गोजातीय नाभिक लुगूपस) तक तेजी से कम हो जाती है । वयस्क मवेशियों में 71 कोशिकाएं/एमएम ² (एनुलस फाइब्रोसस) रिस्पना। 106 कोशिकाएं/एमएम ² (न्यूक्लियस पल्पोसस) देखी जाती हैं(चित्रा 6 ए-बी)। Apotome के साथ द्वि-चैनल इमेजिंग का उपयोग स्थानिक पैटर्न(चित्रा 7)के 3 डी वास्तुकला की कल्पना करने की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्रा 1। इंटरवर्टेब्रल डिस्क की स्थूल शरीर रचना। इंटरवर्टेब्रल डिस्क की योजनाबद्ध ड्राइंग जिसमें नाभिक पल्पोसस (लाल) दिखाई देता है, सीधे इसके चारों ओर मध्यवर्ती क्षेत्र (गुलाबी), और फिर इसके चारों ओर परिपत्र परतों में एनुलस फाइब्रोसस। एनुलस फाइब्रोसस में कोलेजन टाइप आई फाइबर की प्लाई-एंगल दिशा पर ध्यान दें। नाभिक के लिए अक्षीय भार इस प्रकार कोलेजन फाइबर के अक्षीय तन्य बलों के लिए अनुवाद किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। chondrocytes के विभिन्न स्थानिक संगठनात्मक पैटर्न का योजनाबद्ध चित्रण। ऊतक के आधार पर कोन्ड्रोसाइट्स स्वस्थ उपास्थि में एकल कोशिकाओं, जोड़े या तार के रूप में पाए जाते हैं। शुरुआत के साथ इन पैटर्न डबल तार, छोटे समूहों और फिर अंत चरण पतन में बड़े समूहों के रूप में बदल जाते हैं । इस आंकड़े को दानालचे, एम एट अल21से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) की विभिन्न स्थितियां। (ए-डी))मानव काठ की रीढ़ की हड्डी(ए-डी)की Sagittal T2-भारित चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, बढ़ाया गति खंड L4/L5(A'-D'केसाथ) । रोगी के वेंट्रल साइड को छोड़ दिया जाता है, पृष्ठीय पक्ष रीढ़ की हड्डी के साथ सही चेहरे के साथ मस्तिष्कद्रव के लिए अपने सफेद संकेत के साथ। (A,A') उच्च कोलेजन प्रकार I सामग्री के कारण हाइपॉइंटेंज (ब्लैक) सिग्नल के साथ प्रदर्शित एनुलस के साथ अक्षुण्ण आईवीडी और पानी-बाध्यकारी प्रोटियोग्लिकन (फीरमैन ग्रेड19 I) की उच्च सामग्री के कारण नाभिक ने बहुत उज्जवल (हाइपरइंटेन्स) प्रदर्शित किया। (B,B') नाभिक पल्पोसस से पानी के संकेत के नुकसान के साथ IVD अध: पतन की शुरुआत और जहां एनुलस और नाभिक के बीच अंतर खो जाता है (फीरमान ग्रेड19 IV)। (C,C') एक्यूट न्यूक्लियर प्रोलैप्स अभी भी नाभिक के क्षेत्र में एक प्रमुख पानी संकेत के साथ एक अन्यथा बरकरार आईवीडी और डिस्क ऊतक रीढ़ की हड्डी में dorsally फैला हुआ है। (D,D') डिस्क, वेंट्रल और पृष्ठीय स्पॉन्डिलोफाइट गठन और कशेरुकी के सबकॉन्ड्रल स्क्लेरोसिस के भीतर एक बड़े पैमाने पर नष्ट आईवीडी के साथ उन्नत डिस्क डिजनरेशन वी के एक फीरमैन ग्रेड19 के अनुरूप है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) की मोज़ेक फ्लोरेसेंस इमेजिंग। एनुलस फाइब्रोसस और नरम नाभिक में अपने घने कोलेजन फाइबर नेटवर्क के साथ आईवीडी की वास्तुकला को स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है। डापी-न्यूक्लियर स्टेनिंग (सफेद) अक्षीय(A1)और sagittal(A2)विमान में सेल वितरण और आईवीडी के भीतर व्यवस्था को दर्शाता है । इन मोज़ेक छवियों से बढ़ाया प्रतिनिधि क्षेत्रों B1में प्रदर्शित कर रहेहै-B4 औरC1-C4 स्थानिक chondrocyte संगठन चित्रण-इस मामले में एकल कोशिकाओं (ग्रीन बॉक्स), जोड़े (ब्लू बॉक्स) और तार (पीला बॉक्स) । ए:स्केल बार 1,000 माइक्रोन, बी 1-बी 4:स्केल बार 200 माइक्रोन, सी 1-सी 4:स्केल बार: 50 माइक्रोन। इस आंकड़े को बोनेयर, एफ.C एट अल22से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। गोजातीय एनुलस फाइब्रोसस और मानव अपक्षय एनुलस फाइब्रोसस के विभिन्न विकासात्मक और परिपक्वता चरण। DAPI परमाणु धुंधला । मोज़ेक छवियां एक अक्षीय खंड(A1)में एक पूरी प्रारंभिक भ्रूणीय डिस्क दिखाती हैं और भ्रूणीय विकास, परिपक्वता और शुरुआत पतन(A2-A8)के दौरान गोजातीय एनुलस की प्रतिनिधि छवियां। (B1-B3) मानव आईवीडी से एनुलस को इंट्राऑपरेटिव रूप से प्राप्त किया गया था। भ्रूणीय डिस्क विकास के दौरान सेलुलर घनत्व में निरंतर कमी देखी जा सकती है। एक उच्च स्थानिक संगठन सेलुलर पैटर्न विशेष रूप से जन्म के आसपास मौजूद लगता है। अध: पतन के दौरान वयस्क मानव डिस्क में, सेलुलर घनत्व फिर से बढ़ता है और बढ़ते क्लस्टर गठन को देखा जा सकता है। स्केल बार 100 माइक्रोन। वोग: गर्भ के सप्ताह। इस आंकड़े को बोनेयर, एफ.C एट अल22से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6। गोजातीय इंटरवर्टेब्रल डिस्क के विकास और परिपक्वता के दौरान सेलुलर घनत्व में कमी। मिमी ² प्रति औसत (मानक विचलन) सेल काउंट गोजातीय एनुलस फाइब्रोसस(ए)और गोजातीय नाभिक लुगूलोसस(बी)के लिए बार डायग्राम द्वारा सचित्र है। सेलुलर घनत्व की स्पष्ट कमी विशेष रूप से भ्रूणीय अवधि के दौरान देखी जा सकती है जो डिस्क (एन = 72) की पूर्ण परिपक्वता तक कम से कम एक हद तक जारी रहती है। वोग: गर्भ के सप्ताह। इस आंकड़े को बोनेयर, एफ.C एट अल22से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7। इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) की एपॉटोम इमेजिंग। द्वि-चैनल छवि साइटोप्लाज्म (लाल, ऐक्टिन स्टेनिंग) और नाभिक (नीला, दापी परमाणु धुंधला) दिखा। (क)अक्षुण्ण आईवीडी में एकल कोन्ड्रोसाइट्स के प्रमुख स्थानिक पैटर्न के अलावा जोड़े भी पाए जाते हैं । (ख)डिरिंजेड एनुलस सेल क्लस्टर में पाया जा सकता है। स्केल बार 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1. एक 3 डी मॉडल के रूप में इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) में एक जोड़ी की Apotome इमेजिंग। द्वि-चैनल छवियां एक जोड़ी के साइटोप्लाज्म (लाल, ऐक्टिन स्टेनिंग) और नाभिक (नीले, DAPI परमाणु धुंधला) दिखा। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2. 3डी मॉडल के रूप में इंटरवर्टेब्रल डिस्क (आईवीडी) में एक क्लस्टर की एपॉटोम इमेजिंग। द्वि-चैनल छवियां एक क्लस्टर के साइटोप्लाज्म (लाल, ऐक्टिन स्टेनिंग) और नाभिक (नीले, DAPI परमाणु धुंधला) दिखा। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: अपने विभिन्न मील के पत्थर के साथ जन्म के बाद गोजातीय भ्रूण विकास, परिपक्वता और विकास। वोग - गर्भ के सप्ताह। गर्भावधि सीए 283 दिन, प्राकृतिक जीवन प्रत्याशा 20-25 वर्ष20,23,24। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

मोज़ेक इमेजिंग और ऑप्टिकल सेक्शनिंग द्वारा संवर्धित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, हमने पूरे विकास, परिपक्वता और पतन के दौरान काठ IVD के एनुलस में कोन्ड्रोसाइट्स की स्थानिक व्यवस्था का मूल्यांकन किया। जबकि अपक्षयी ऊतक डिस्क अध: पतन के लिए रीढ़ की सर्जरी प्राप्त रोगियों से काटा जा सकता है, भ्रूण अवधि और परिपक्वता चरण के विश्लेषण के लिए एक मॉडल जीव (गोजातीय) के उपयोग की आवश्यकता है । प्रारंभिक भ्रूणीय विकास के दौरान एनुलस में उच्च सेलुलर घनत्व का उल्लेख किया गया था। विकास के आगे के पाठ्यक्रम में, प्रसवोत्तर विकास और परिपक्वता सेलुलर घनत्व में एक स्पष्ट कमी देखी जा सकती है। उन्नत डिस्क अध: पतन के साथ मानव ऊतक में, हम तब एनुलस फाइब्रोसस में सेलुलर घनत्व में वृद्धि की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं।

ऊतक की मात्रा में तेजी से वृद्धि , जिसमें सक्रिय रूप से विभाजित और बायोसिंथेटिक रूप से सक्रिय नोटोकॉर्डल कोशिकाएं भ्रूण25में पाए गए सेलुलर घनत्व में परिवर्तन के संभावित कारण हैं । तंत्र जिसके द्वारा सेलुलर घनत्व फिर से पतन के साथ बढ़ जाती है, हालांकि, अभी भी स्पष्ट नहीं है । एनुलस की अपक्षयी प्रक्रियाओं से ऊतक अंतरवण और सूजन, मैट्रिक्स-अपमानजनक एंजाइमों और विकास कारक उत्पादन के अपरेगुलेशन सहित रोग परिवर्तनों की एक श्रृंखला होती है, और सेलुलरिटी26,27, 28में भी परिवर्तनहोताहै।

आर्टिकुलर कार्टिलेज7से ज्ञात पैटर्न के आधार पर सेलुलर स्थानिक संगठन के एक कार्य के रूप में सेल उपस्थिति पर विचार करते समय,9 हमें प्रारंभिक भ्रूणीय डिस्क में कोई पहचानने योग्य स्थानिक संगठन नहीं मिला जहां कोशिकाएं घनी पैक हो जाती हैं और जिन्हें हम एकल कोशिकाओं के रूप में उपस्थित मानते हैं22. यह निष्कर्ष भ्रूणीय आर्टिकुलर कार्टिलेज7के परिणामों के अनुरूप है । स्वस्थ परिपक्व एनुलस में, एकल कोशिकाएं प्रमुख स्थानिक पैटर्न22का प्रतिनिधित्व करती हैं। जोड़े और स्ट्रिंग-संरचनाओं, हालांकि,22भी मनाया जा सकता है। मानव डिस्क में ऊतक जितनी अधिक पतित होती है, कोशिकाओं का अनुपात उतना ही अधिक होता है जो समूहों में पाया जा सकता है22. आर्टिकुलर कार्टिलेज7,9, 29में रोलफ्स द्वारा सुझाए गए फिजियोपैथोलॉजिकल मॉडल हमारे निष्कर्षों में एक पेचीदा समानता दिखाता है। आईवीडी डिजनरेशन के पिछले अध्ययनों में भी पहले से ही क्लस्टर निर्माण को डिस्क डिजनरेशन 14 , 30,31,32,33की पहचान के रूप में रेखांकित किया गया था। चूंकि ये क्लस्टर ज्यादातर अत्यधिक विकृत ऊतकों में पाए जा सकते हैं, क्लस्टर गठन अपक्षयी क्षति34की मरम्मत के लिए ऊतक के असफल प्रयास का संकेत हो सकता है। स्थानीय रूप से प्रमुख कोनड्रोसाइट पैटर्न और ऊतक लोच के बीच एक मजबूत संबंध स्थापित करना, इन पैटर्न की एक उच्च कार्यात्मक प्रासंगिकता आर्टिकुलर कार्टिलेज10, 11में प्रदर्शित की जा सकती है। यह अनुमान लगाया जा सकता है कि इस तरह की कार्यात्मक प्रासंगिकता आईवीडी में स्थानिक chondrocyte संगठन पर भी लागू होती है।

फ्लोरेसेंस हिस्टोलॉजिक विश्लेषण ऊतकों में मॉर्फोलॉजिक परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए आने में आसान और आकर्षक साधन हैं। जब हिस्टोलॉजिकल रूप से आईवीडी का विश्लेषण करने की कोशिश कर रहे हैं, तो अलग तकनीकी कठिनाइयों को दूर करने की आवश्यकता है: सबसे पहले, मानव ऊतक की सीमित उपलब्धता एक पर्याप्त पशु मॉडल जीव का चयन करना महत्वपूर्ण बनाती है जिसके साथ रोग के उन पहलुओं का अध्ययन किया जा सकता है जहां मानव नमूने प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं। इस अध्ययन में संबोधित शोध प्रश्न के लिए, हमने एक गोजातीय पशु मॉडल चुना।

दूसरे, कोलेजन प्रकार आई-रिच आईवीडी का प्रसंस्करण अधिकांश अन्य मानव ऊतकों की तुलना में बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण है। घने कोलेजन प्रकार आई-फाइबर नेटवर्क दृढ़ता से फ्लोरेस्किंग प्रकाश को एक उच्च पृष्ठभूमि शोर संकेत बनाते हुए तितर-बितर करता है। इस समस्या को एक तकनीक का उपयोग करके सबसे अच्छा संबोधित किया जाता है जो इस तरह के पृष्ठभूमि संकेत के घटाव या उन्मूलन की अनुमति देता है। ऐसा करने के लिए एक प्रसिद्ध तरीका कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी है। जबकि कॉन्फोकल अधिग्रहीत लेजर-छवियों की छवि गुणवत्ता आमतौर पर उत्कृष्ट होती है, इस तकनीक के नुकसान यह हैं कि यह अपेक्षाकृत समय लेने वाला है और इस तरह यह मोज़ेक इमेजिंग के माध्यम से बड़े ऊतक क्षेत्रों के विश्लेषण की अनुमति नहीं देता है। दूसरे confocal माइक्रोस्कोप अपेक्षाकृत महंगे है और हर जगह उपलब्ध नहीं हैं । पृष्ठभूमि शोर को फ़िल्टर करने का एक बहुत तेज़ और सस्ता तरीका एपोटोम के माध्यम से ऑप्टिकल सेक्शनिंग करना है।

निष्कर्षों की सही व्याख्या करने में सक्षम होने के लिए, आईवीडी में अपने मूल के लिए विश्लेषण किए जाने वाले ऊतकों को भी सही ढंग से आवंटित करना आवश्यक है। हालांकि यह कार्य चयन करने के लिए एक संपूर्ण गोजातीय डिस्क होने पर अपेक्षाकृत सरल है, ऑपरेशन थिएटर से मानव ऊतक प्राप्त करते समय यह बहुत चुनौतीपूर्ण हो सकता है। एनुलस फाइब्रोसस की विशेषता विशेषता एक कोण-प्लाई फाइबर ओरिएंटेशन में इसका बहुत घने कोलेजन प्रकार I नेटवर्क है। इसके विपरीत, नाभिक एक असंगत जिलेटिन संरचना है जहां नग्न आंखों के लिए कोई उच्च कोलेजन वास्तुकला दिखाई नहीं देती है। मध्यवर्ती क्षेत्र उन दो चरम के बीच स्थित है और एक स्पष्ट कोलेजन फाइबर वास्तुकला भी है, लेकिन यह एनुलस फाइब्रोसस की तुलना में बहुत नरम और कम घना है। कार्टिलाजिनस एंडप्लेट में हाइलिन उपास्थि होती है, नग्न आंखों द्वारा पहचानने योग्य कोलेजन वास्तुकला के साथ मौजूद नहीं होती है लेकिन यह "ग्लास-जैसे" है जैसा कि "हाइलिन" शब्द से पता चलता है। नाभिक लुगूलोसस के विपरीत, हालांकि, बहुत कठोर भी है, विकृत नहीं किया जा सकता है, और सबकॉन्ड्रल हड्डी पर स्थित है जिसे अक्सर अभी भी ऊतक के निरीक्षण से पहचाना जा सकता है।

एक बार जब ऊतक मूल की सही ढंग से पहचान की गई है, तो ऊतक को मानकीकृत छवियों को प्राप्त करने के लिए अनुभागिंग के लिए अभी भी सही ढंग से उन्मुख होने की आवश्यकता है जो उचित गुणात्मक और मात्रात्मक रीड-आउट की अनुमति भी देते हैं। चुंबकीय-अनुनाद इमेजिंग जैसी अन्य इमेजिंग तकनीकों के अभिविन्यास में हम दो मानक विश्लेषण-विमानों का सुझाव देते हैं: एक औसत-धनु अनुभाग और एक अक्षीय विमान में। ये दोनों विमान एनुलस के कोलेजन टाइप आई-फाइबर नेटवर्क की वास्तुकला का भी अच्छा प्रभाव प्रदान करेंगे। एफ-ऐक्टिन धुंधला से प्राप्त निष्कर्षों की व्याख्या करते समय यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि ऊतक के नमूनों की ठंड से साइटोस्केलेटल संरचना परिवर्तन हो सकता है35 जो, हालांकि, स्थानिक chondrocyte संगठन को प्रभावित नहीं करना चाहिए।

आईवीडी के सेलुलर जीव विज्ञान को पूरी तरह से समझना डिस्क अध: पतन और उत्थान36के बारे में हमारी समझ में अभी भी खुली चुनौतियों में से एक है। प्रश्न जो कभी-कभी तुच्छ लगते हैं, जैसे स्वस्थ ऊतकों में कोशिकाओं की शारीरिक व्यवस्था या पतन के दौरान सेलुलर पुनर्गठन का सवाल, आज तक, अनुत्तरित रहते हैं। प्राप्त ज्ञान हमें ऊतक की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने, क्लस्टर गठन की प्रतिवर्तीता की जांच करने और इस प्रकार संभवतः एक चिकित्सीय खिड़की को परिभाषित करने के लिए इस छवि-आधारित अध: पतन मार्कर का उपयोग करने की अनुमति दे सकता है जिसमें अपक्षय प्रक्रियाओं को अभी भी सफलतापूर्वक लक्षित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उनकी मदद और समर्थन के लिए मूल प्रकाशनों से हमारे सह लेखकों का शुक्रिया अदा करते हैं । हम शार्लोट एम्मा बम्बर्जर को apotome छवियों को प्राप्त करने में मदद करने के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Merck KGaA,  Germany A2942
Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus R. Langenbrinck, Germany 03-0060
ApoTome Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany 462000115
AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany
CellMask Actin Tracking Stain Thermo Fischer Scientific, US A57249
Cryostat Leica Biosystems, US CM3050S
DAPI Thermo Fischer Scientific, US D1306
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Gibco, Life Technologies, Germany 41966052
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich, US 60004
Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany 3834000604
Formaldehyde Merck KGaA,  Germany 104002
Image J 1.53a, with Cell counter plugin National Insittute of Health (NIH), US
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin Thermo Fischer Scientific, US A12380
Microscopic Cover Glasses R. Langenbrinck, Germany 01-1818/1
PAP Pen Liquid Blocker Science Sevices  GmbH, Germany N71310
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich, US P4333
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich,US P5119
Scalpel pf medical AG, Germany 2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compound Sakura Finetek, Netherlands SA6255012

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References

  1. Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
  2. Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
  3. Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
  4. Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
  5. Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
  6. Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  7. Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
  8. Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
  9. Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
  10. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409 (2019).
  11. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  12. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  13. Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, Suppl 1 10 (2012).
  14. Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
  15. Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
  16. Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), Phila Pa. 755-762 (1999).
  17. Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), Phila Pa. 2793-2799 (2004).
  18. Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
  19. Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), Phila Pa. 1873-1878 (2001).
  20. Habermehl, K. H. Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , Paul Parey. Berlin, Hamburg. (1975).
  21. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  22. Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198 (2021).
  23. Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
  24. Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
  25. Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
  26. Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
  27. Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
  28. Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
  29. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  30. Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, Pt 4 680-682 (2007).
  31. Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, Pt 6 864-869 (2002).
  32. Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15 (2017).
  33. Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
  34. Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), Oxford. 5-10 (2009).
  35. Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382 (2019).
  36. McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3 (2016).

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जीव विज्ञान अंक 173 इंटरवर्टेब्रल डिस्क स्थानिक चूंड्रोसाइट संगठन भ्रूण विकास डिस्क अध: पतन चोंड्रोसाइट सेल क्लस्टर गठन
भ्रूण विकास से अध: पतन तक इंटरवर्टेब्रल डिस्क का ऑप्टिकल सेक्शनिंग और विज़ुअलाइज़ेशन
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Bonnaire, F. C., Feierabend, M.,… More

Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Wolfgart, J. M., Breuer, W., Walter, C., Hofmann, U. K., Danalache, M. Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration. J. Vis. Exp. (173), e62594, doi:10.3791/62594 (2021).

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