हेमिप्टेरन गट्स में प्लांट वायरस और कीट वेक्टर प्रोटीन की इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग
Summary
उत्पादित कीट आंत में पौधे वायरस प्रोटीन और वेक्टर कीट प्रोटीन दोनों के इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग वायरस और वेक्टर कीटों, कीट प्रोटीन कार्यों और वायरस संचरण के अंतर्निहित आणविक तंत्र के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
प्रकृति में अधिकांश पौधों के वायरस हेमिप्टेरन कीड़ों द्वारा एक पौधे से दूसरे पौधे में प्रेषित होते हैं। वेक्टर कीटों का एक उच्च जनसंख्या घनत्व जो वायरस संचरण में अत्यधिक कुशल हैं, खेतों में वायरस महामारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। वायरस-कीट वेक्टर इंटरैक्शन का अध्ययन पौधों के वायरस और उनके वेक्टर कीटों को नियंत्रित करने के लिए नई रणनीतियों को डिजाइन करने के उद्देश्य से वायरस संचरण और महामारी की हमारी समझ को आगे बढ़ा सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग का व्यापक रूप से रोगजनकों और मेजबानों के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है और इसका उपयोग यहां सफेद-समर्थित प्लांटहॉपर (डब्ल्यूबीपीएच, सोगाटेला फरसीफेरा) में किया जाता है, जो मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं में विषाणुओं और कीट प्रोटीन का पता लगाने के लिए दक्षिणी चावल काले लकीर वाले बौने वायरस (एसआरबीएसडीवी, जीनस फिजीवायरस, परिवार रिओविरिडे) को कुशलतापूर्वक प्रसारित करता है। लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, हमने मिडगट उपकला कोशिकाओं की रूपात्मक विशेषताओं, कीट प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण और वायरियन और एक कीट प्रोटीन के कोलोकलाइजेशन का अध्ययन किया। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कीड़ों में वायरस की गतिविधियों, कीट प्रोटीन के कार्यों और वायरस और वेक्टर कीट के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
अधिकांश वर्णित पौधों के वायरस हेमिप्टेरा क्रम से कीड़ों द्वारा प्रेषित होते हैं जिसमें एफिड्स, व्हाइटफ्लाइज़, लीफहॉपर, प्लांटहॉपर और थ्रिप्स 1,2 शामिल हैं। हेमिप्टेरन कीटों के भेदी-चूसने वाले मुंह के हिस्से लार को खिलाने और स्रावित करने के लिए पौधे के ऊतकों को छेदते हैं, सहवर्ती रूप से वायरस2 को कुशलतापूर्वक प्रसारित करते हैं। वेक्टर कीटों द्वारा पौधों के वायरस के विभिन्न संचरण तंत्र का वर्णन किया गया है। इनमें गैर-निरंतर, अर्ध-स्थायी और निरंतर शामिल हैं। लगातार प्रकार या तो गैर-प्रचारक याप्रचारात्मक 3,4 है, लेकिन इन दोनों प्रकारों के लिए, संचारित वायरस को कीट के पूरे शरीर में स्थानांतरित होना चाहिए। लगातार-प्रचार मोड में, वायरस शुरू में कीट की आंत के उपकला कोशिकाओं में संक्रमित और प्रतिकृति करते हैं, फिर विभिन्न ऊतकों में फैलते हैं, और अंततः लार ग्रंथियों में फैलते हैं, जहां से उन्हें कीट खिलानेके दौरान लार के माध्यम से पौधे में पेश किया जा सकता है। लगातार संचारित वायरस विभिन्न अंगों के माध्यम से चलते हैं और अपने कीट वैक्टर में प्रतिकृति करते हैं, जिसके लिए विभिन्न चरणोंमें वायरस और वेक्टर घटकों के बीच विशिष्ट बातचीत की आवश्यकता होती है।
वायरल प्रोटीन और कीट प्रोटीन को वेक्टरकीटों में वायरस की पहचान, संक्रमण, प्रतिकृति या प्रसार के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को सुविधाजनक बनाने के लिए बातचीत करनी चाहिए। यद्यपि ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कीड़ों में सेलुलर संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, यह वायरल प्रोटीन और कीट प्रोटीन के वायरियन वितरण, सेलुलर स्थानीयकरण या कोलोकलाइजेशन, या कीट ऊतकों और कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चर को नहीं दिखा सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग पहली बार कून्स एट अल द्वारा माउस की फागोसाइटिक कोशिकाओं में विशिष्ट फ्लोरेसिन एंटीबॉडी को लेबल करने केमाध्यम से की गई थी, और अब इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक, जिसे फ्लोरेसेंस एंटीबॉडी तकनीक के रूप में भी जाना जाता है, विकसित शुरुआती इम्यूनोलॉजिकल लेबलिंग तकनीकों में से एक है और एंटीजन और एंटीबॉडी11,12 के बीच विशिष्ट बाध्यकारी प्रतिक्रिया पर आधारित है। ज्ञात एंटीबॉडी को पहले फ्लोरेसिन के साथ लेबल किया जाता है, जिसका उपयोग कोशिकाओं या ऊतकों13,14 में संबंधित एंटीजन का पता लगाने के लिए एक जांच के रूप में किया जाता है। फ्लोरेसिन-लेबल एंटीबॉडी कोशिकाओं या ऊतकों में संबंधित एंटीजन को बांधने के बाद, जांच उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ विकिरणित होने पर उज्ज्वल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करेगी और एंटीजन15 को स्थानीयकृत करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ देखी जाएगी।
पौधों के वायरस के अधिकांश वेक्टर कीड़े हेमिप्टेरान्स हैं। वेक्टर कीटों का एक उच्च जनसंख्या घनत्व जिसमें पौधे के वायरस के लिए उच्च संचरणदक्षता है, वायरस महामारी का कारण बन सकता है। दक्षिणी चावल की काली लकीर वाले बौने वायरस (एसआरबीएसडीवी, जीनस फिजीवायरस, परिवार रिओविरिडे), चावल के सबसे गंभीर रोगजनकों में से एक, तेजी से पूर्व और दक्षिण पूर्व एशिया में चावल उगाने वाले क्षेत्रों में फैल गया है, और 201016,17 के बाद से गंभीर उपज नुकसान का कारण बना है। सफेद समर्थित प्लांटहॉपर (डब्ल्यूबीपीएच, सोगाटेला फरसिफेरा हॉर्वथ) के वयस्क और अप्सरा उच्च दक्षता के साथ लगातार-प्रचारित तरीके से एसआरबीएसडीवी को चावल में संचारित करते हैं। फील्ड अध्ययनों से पता चला है कि एसआरबीएसडीवी-प्रेरित चावल की काली लकीर वाली बौनी बीमारी का प्रकोप आमतौर पर डब्ल्यूबीपीएच के बड़े पैमाने पर लंबी दूरी के प्रवास के साथ मेल खाता है, जो एसआरबीएसडीवी महामारी 7,8,18 में एक महत्वपूर्ण कारक है। पुटिका से जुड़े झिल्ली प्रोटीन 7 (वीएएमपी 7) एक घुलनशील एन-एथिलमलीमाइड-संवेदनशील कारक अनुलग्नक प्रोटीन रिसेप्टर (एसएनएआरई) है, जो पुटिका संलयन के माध्यम से पदार्थों के परिवहन को मध्यस्थ कर सकता है। वीएएमपी 7 विट्रो में एसआरबीएसडीवी के बाहरी प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन के साथ बातचीत करता है, जो इंगित करता है कि वीएएमपी 7 वायरस ट्रांसमिशन16 के साथ निकटता से जुड़ा हो सकता है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हमने मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं16 में एसआरबीएसडीवी वायरियन और वीएएमपी 7 को लेबल करने के लिए एक उदाहरण के रूप में वायरल डब्ल्यूबीपीएच से आंत का उत्पादन किया। वायरस के प्रारंभिक आक्रमण स्थल के रूप में, मिडगट एपिथेलियम वायरस संक्रमण, प्रतिकृति और संचरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सबसे पहले, हमने डब्ल्यूबीपीएच के अप्सराओं और वयस्कों से आंत को आबकारी करने के चरणों का विवरण दिया। दूसरा, हमने आंत उपकला कोशिकाओं में एसआरबीएसडीवी वायरियन और वीएएमपी 7 को लेबल करने के लिए विशिष्ट फ्लोरेसिन-लेबल एंटीबॉडी का उपयोग किया। फिर हमने एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से उपकला कोशिकाओं और वायरियन और वीएएमपी 7 के सेलुलर स्थान को देखा। परिणामों से पता चला है कि एसआरबीएसडीवी वायरियन और वीएएमपी 7 मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में सह-स्थानीयकरण कर सकते हैं, यह सुझाव देते हुए कि वीएएमपी 7 का विशिष्ट कार्य मिडगट एपिथेलियल कोशिकाओं से विषाणुओं के प्रसार से संबंधित हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सर्वोत्तम परिणामों के लिए, कुछ प्रमुख बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, कुल आबादी के बीच विषाणुभक्षी कीड़ों का एक उच्च अनुपात आवश्यक है। यद्यपि डब्ल्यूबीपीएच अप्सराओं और वयस्कों द्वारा एस…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31630058 से X.W. और W.L. को 31772134) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
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