Questo protocollo per la marcatura immunofluorescente sia delle proteine del virus vegetale che delle proteine degli insetti vettori nelle viscere degli insetti asportati può essere utilizzato per studiare le interazioni tra virus e insetti vettori, le funzioni delle proteine degli insetti e i meccanismi molecolari alla base della trasmissione del virus.
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Articolo metodologico
Marcatura immunofluorescente di virus vegetali e proteine di insetti vettori nell'intestino degli emitteri
In questo articolo
Sommario
Abstract
La maggior parte dei virus vegetali in natura sono trasmessi da una pianta all'altra dagli insetti emitteri. Un'alta densità di popolazione di insetti vettori che sono altamente efficienti nella trasmissione del virus gioca un ruolo chiave nelle epidemie di virus nei campi. Lo studio delle interazioni virus-insetto vettore può far progredire la nostra comprensione della trasmissione del virus e delle epidemie con l'obiettivo di progettare nuove strategie per controllare i virus delle piante e i loro insetti vettori. La marcatura con immunofluorescenza è stata ampiamente utilizzata per analizzare le interazioni tra patogeni e ospiti ed è utilizzata qui nella cicalina dal dorso bianco (WBPH, Sogatella furcifera), che trasmette in modo efficiente il virus nano striato nero del riso meridionale (SRBSDV, genere Fijivirus, famiglia Reoviridae), per localizzare i virioni e le proteine degli insetti nelle cellule epiteliali dell'intestino medio. Utilizzando la microscopia confocale a scansione laser, abbiamo studiato le caratteristiche morfologiche delle cellule epiteliali dell'intestino medio, la localizzazione cellulare delle proteine degli insetti e la colocalizzazione dei virioni e di una proteina dell'insetto. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare le attività dei virus negli insetti, le funzioni delle proteine degli insetti e le interazioni tra virus e insetto vettore.
Introduzione
I virus vegetali più descritti sono trasmessi dagli insetti dall'ordine Hemiptera che include afidi, mosche bianche, cicaline, cicaline e tripidi 1,2. L'apparato boccale penetrante-succhiatore degli insetti emitteri perfora il tessuto vegetale per nutrire e secernere la saliva, trasmettendo contemporaneamente in modo efficiente il virus2. Sono stati descritti diversi meccanismi di trasmissione dei virus vegetali da parte di insetti vettori. Questi includono non persistente, semipersistente e persistente. Il tipo persistente è non propagante o propagante3,4, ma pe....
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Protocollo
1. Allevamento di insetti non viruliferi
- Raccogliere WBPHs dalle risaie e retrocedere con piantine di riso in bicchieri di vetro da 1 L coperti con rete a prova di insetti in un'incubatrice a 28 °C con 16 ore di luce e 8 ore di buio. Poiché SRBSDV non viene trasmesso attraverso le uova, le ninfe appena nate non sono virulifere.
- Con una penna, spazzola delicatamente gli insetti dal becher che alleva insetti in un nuovo becher di piantine di riso fresco ogni settimana fino a quando le ninfe WBPH non si sono schiuse. Continua ad allevare queste ninfe non virulifere tratteggiate a 2 o 3 pollici.
NOTA: Spazzolare con attenzione per evitare che i WBPH....
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Risultati
La Figura 1 illustra tutte le fasi di questo protocollo: allevamento di insetti, acquisizione del virus, escissione dell'intestino, marcatura immunofluorescente e realizzazione del vetrino.
Le budella WBPH asportate dagli adulti sono state fissate in paraformaldeide al 4% (m/v), permeabilizzate con Triton X-100 al 2% (v/v) e quindi incubate con Dylight 633 falloidina10,18. La micrografia confocale a scansi.......
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Discussione
Per ottenere i migliori risultati, è necessario considerare alcuni punti chiave. In primo luogo, è necessario un alto rapporto di insetti viruliferi tra la popolazione totale. Sebbene l'AAP minimo per SRBSDV da parte di ninfe e adulti WBPH sia di 5 min17, gli insetti dovrebbero essere autorizzati a nutrirsi di piante di riso fresche infette da SRBSDV per 2 d per ottenere un'efficienza di acquisizione fino all'80%. Poiché i virioni SRBSDV possono essere rilevati nell'80% delle viscere medie
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31630058 a X.W. e 31772134 a W.L.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3% Albumina sierica di toro (BSA) | Coolaber | SL1331 | Anticorpi diluiti |
| Vetro di copertura | Solarbio | YA0771-18*18mm | Per la creazione di vetrini |
| Microscopio da dissezione | Beitja | XTL-7045B1 | Per la dissezione di insetti |
| Microscopio confocale a scansione laser | Zeiss Zeiss | LSM880 | Osservare il segnale di fluorescenza |
| Vetrini per microscopio | Solarbio | ZBP-7105 | Per la produzione di vetrini |
| Mezzo di montaggio con 4'6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Abcam | AB104139 | Etichetta cellulare necleus |
| Paraformaldeide | Sigma | 158127 | Per la fissazione dei tessuti |
| Falloidina | Invitrogen | A22284 | Etichetta actina di epitielli dell'intestino medio |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | permeazione dei tessuti |
| (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | Per la dissezione di insetti |
Riferimenti
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2....
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Ristampe e permessi
