Marcatura immunofluorescente di virus vegetali e proteine di insetti vettori nell'intestino degli emitteri

Summary

Questo protocollo per la marcatura immunofluorescente sia delle proteine del virus vegetale che delle proteine degli insetti vettori nelle viscere degli insetti asportati può essere utilizzato per studiare le interazioni tra virus e insetti vettori, le funzioni delle proteine degli insetti e i meccanismi molecolari alla base della trasmissione del virus.

Abstract

La maggior parte dei virus vegetali in natura sono trasmessi da una pianta all’altra dagli insetti emitteri. Un’alta densità di popolazione di insetti vettori che sono altamente efficienti nella trasmissione del virus gioca un ruolo chiave nelle epidemie di virus nei campi. Lo studio delle interazioni virus-insetto vettore può far progredire la nostra comprensione della trasmissione del virus e delle epidemie con l’obiettivo di progettare nuove strategie per controllare i virus delle piante e i loro insetti vettori. La marcatura con immunofluorescenza è stata ampiamente utilizzata per analizzare le interazioni tra patogeni e ospiti ed è utilizzata qui nella cicalina dal dorso bianco (WBPH, Sogatella furcifera), che trasmette in modo efficiente il virus nano striato nero del riso meridionale (SRBSDV, genere Fijivirus, famiglia Reoviridae), per localizzare i virioni e le proteine degli insetti nelle cellule epiteliali dell’intestino medio. Utilizzando la microscopia confocale a scansione laser, abbiamo studiato le caratteristiche morfologiche delle cellule epiteliali dell’intestino medio, la localizzazione cellulare delle proteine degli insetti e la colocalizzazione dei virioni e di una proteina dell’insetto. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare le attività dei virus negli insetti, le funzioni delle proteine degli insetti e le interazioni tra virus e insetto vettore.

Introduction

I virus vegetali più descritti sono trasmessi dagli insetti dall’ordine Hemiptera che include afidi, mosche bianche, cicaline, cicaline e tripidi ^1,2. L’apparato boccale penetrante-succhiatore degli insetti emitteri perfora il tessuto vegetale per nutrire e secernere la saliva, trasmettendo contemporaneamente in modo efficiente il virus². Sono stati descritti diversi meccanismi di trasmissione dei virus vegetali da parte di insetti vettori. Questi includono non persistente, semipersistente e persistente. Il tipo persistente è non propagante o propagante^3,4, ma per entrambi questi tipi^, il virus trasmesso deve muoversi in tutto il corpo dell’insetto. Nella modalità persistente-propagativa, i virus inizialmente infettano e si replicano nelle cellule epiteliali dell’intestino dell’insetto, quindi si diffondono in diversi tessuti e infine nelle ghiandole salivari, da dove possono quindi essere introdotti in una pianta attraverso la saliva durante l’alimentazione degli insetti ^5,6. I virus trasmessi persistenti si muovono attraverso diversi organi e si replicano nei loro insetti vettori, il che richiede interazioni specifiche tra virus e componenti vettoriali in diversi stadi ^7,8.

Le proteine virali e le proteine degli insetti devono interagire per facilitare i processi critici per il riconoscimento, l’infezione, la replicazione o la diffusione del virus negli insetti vettori ^9,10. Sebbene la microscopia ottica possa essere utilizzata per osservare le strutture cellulari negli insetti, non può mostrare la distribuzione dei virioni, la localizzazione cellulare o la colocalizzazione delle proteine virali e delle proteine degli insetti o l’ultrastruttura dei tessuti e delle cellule degli insetti. La marcatura con immunofluorescenza è stata eseguita per la prima volta da Coons et al. nelle cellule fagocitiche del topo mediante marcatura di anticorpi specifici contro la fluoresceina, e ora è ampiamente utilizzata¹¹. La tecnica di immunofluorescenza, nota anche come tecnica degli anticorpi di fluorescenza, è una delle prime tecniche di marcatura immunologica sviluppate e si basa sulla specifica reazione di legame tra l’antigene e l’anticorpo^11,12. L’anticorpo noto viene prima marcato con fluoresceina, che viene utilizzata come sonda per rilevare gli antigeni corrispondenti nelle cellule o nei tessuti^13,14. Dopo che l’anticorpo marcato con fluoresceina si lega all’antigene corrispondente nelle cellule o nei tessuti, la sonda emetterà fluorescenza brillante quando irradiata con lunghezze d’onda di eccitazione e osservata con un microscopio a fluorescenza per localizzare l’antigene¹⁵.

La maggior parte degli insetti vettori dei virus vegetali sono emitteri. Una maggiore densità di popolazione di insetti vettori che hanno un’elevata efficienza di trasmissione del virus vegetale può portare a epidemie di virus⁵. Il virus nano striato nero del riso meridionale (SRBSDV, genere Fijivirus, famiglia Reoviridae), uno dei patogeni più gravi del riso, si è rapidamente diffuso in tutte le aree di coltivazione del riso nell’Asia orientale e sudorientale e ha causato gravi perdite di resa dal 2010^16,17. Gli adulti e le ninfe della cavalletta dorsobianco (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) trasmettono SRBSDV al riso in modo persistente-propagativo con alta efficienza. Studi sul campo hanno dimostrato che i focolai di malattia nana striata nera indotta da SRBSDV di solito coincidono con la migrazione di massa a lunga distanza di WBPHs, un fattore cruciale nelle epidemie di SRBSDV 7,8,18. La proteina di membrana 7 associata alla vescicola (VAMP7) è un recettore solubile della proteina di attaccamento del fattore N-etilmaleimmide sensibile (SNARE), che può mediare il trasporto di sostanze attraverso la fusione delle vescicole. VAMP7 interagisce con la proteina capside maggiore esterna di SRBSDV in vitro, il che indica che VAMP7 potrebbe essere strettamente associato alla trasmissione del virus¹⁶.

Nel protocollo qui presentato, abbiamo asportato l’intestino da WBPH virulifero come esempio per etichettare i virioni SRBSDV e VAMP7 nelle cellule epiteliali dell’intestino medio¹⁶. Come sito di invasione iniziale del virus, l’epitelio dell’intestino medio svolge ruoli vitali nell’infezione, nella replicazione e nella trasmissione del virus. In primo luogo, abbiamo dettagliato i passaggi per asportare l’intestino da ninfe e adulti di WBPHs. In secondo luogo, abbiamo utilizzato anticorpi specifici marcati con fluoresceina per marcare i virioni SRBSDV e VAMP7 nelle cellule epiteliali intestinali. Poi abbiamo osservato le cellule epiteliali e la posizione cellulare dei virioni e VAMP7 tramite un microscopio confocale a scansione laser. I risultati hanno mostrato che i virioni SRBSDV e VAMP7 potrebbero colocalizzarsi nel citoplasma delle cellule epiteliali dell’intestino medio, suggerendo che la funzione specifica di VAMP7 potrebbe essere correlata alla disseminazione di virioni dalle cellule epiteliali dell’intestino medio.

Protocol

1. Allevamento di insetti non viruliferi Raccogliere WBPHs dalle risaie e retrocedere con piantine di riso in bicchieri di vetro da 1 L coperti con rete a prova di insetti in un’incubatrice a 28 °C con 16 ore di luce e 8 ore di buio. Poiché SRBSDV non viene trasmesso attraverso le uova, le ninfe appena nate non sono virulifere. Con una penna, spazzola delicatamente gli insetti dal becher che alleva insetti in un nuovo becher di piantine di riso fresco ogni settimana fino a quando le ninfe WBPH non s…

Representative Results

La Figura 1 illustra tutte le fasi di questo protocollo: allevamento di insetti, acquisizione del virus, escissione dell’intestino, marcatura immunofluorescente e realizzazione del vetrino. Le budella WBPH asportate dagli adulti sono state fissate in paraformaldeide al 4% (m/v), permeabilizzate con Triton X-100 al 2% (v/v) e quindi incubate con Dylight 633 falloidina10,18. La micrografia confocale a scansi…

Discussion

Per ottenere i migliori risultati, è necessario considerare alcuni punti chiave. In primo luogo, è necessario un alto rapporto di insetti viruliferi tra la popolazione totale. Sebbene l’AAP minimo per SRBSDV da parte di ninfe e adulti WBPH sia di 5 min¹⁷, gli insetti dovrebbero essere autorizzati a nutrirsi di piante di riso fresche infette da SRBSDV per 2 d per ottenere un’efficienza di acquisizione fino all’80%. Poiché i virioni SRBSDV possono essere rilevati nell’80% delle viscere medie<sup …

Materials

3% Bull serum albumin (BSA)	Coolaber	SL1331	Dilute antibodies
Cover glass	Solarbio	YA0771-18*18mm	For slide making
Dissecting microscope	Beitja	XTL-7045B1	For insect dissection
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	Zeiss LSM880	Observe fluorescence signal
Microscope slides	Solarbio	ZBP-7105	For slide making
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cell necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For tissues fixation
Phalloidin	Invitrogen	A22284	Label actin of midgut epithiels
Triton X-100	Amresco	0290C484	For tissues permeation
Tweezers (5-SA)	AsOne	6-7905-40	For insect dissection