Иммунофлюоресцентная маркировка белков вирусов растений и насекомых-векторов в полужесткокрылых кишках
Summary
Этот протокол иммунофлуоресцентной маркировки как белков растительных вирусов, так и белков-векторов насекомых в иссеченных кишках насекомых может быть использован для изучения взаимодействий между вирусными и насекомыми-переносчиками, функций белков насекомых и молекулярных механизмов, лежащих в основе передачи вируса.
Abstract
Большинство вирусов растений в природе передаются от одного растения к другому полужесткокрылыми насекомыми. Высокая плотность популяции насекомых-переносчиков, которые очень эффективны при передаче вируса, играет ключевую роль в вирусных эпидемиях на полях. Изучение взаимодействия вирусов и насекомых-переносчиков может способствовать нашему пониманию передачи вирусов и эпидемий с целью разработки новых стратегий борьбы с вирусами растений и их насекомыми-переносчиками. Иммунофлуоресцентная маркировка широко используется для анализа взаимодействия между патогенами и хозяевами и используется здесь у белоспинного кузнечика (WBPH, Sogatella furcifera), который эффективно передает южный вирус черного карлика риса (SRBSDV, род Fijivirus, семейство Reoviridae), чтобы найти вирионы и белки насекомых в эпителиальных клетках средней кишки. С помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии изучены морфологические характеристики эпителиальных клеток средней кишки, клеточная локализация белков насекомых, колокализация вирионов и белка насекомого. Этот протокол может быть использован для изучения активности вирусов у насекомых, функций белков насекомых и взаимодействия между вирусом и насекомым-переносчиком.
Introduction
Большинство описанных вирусов растений передаются насекомыми из отряда Hemiptera, который включает тлю, белокрылку, цикадку, кузнечиков и трипсов 1,2. Колюще-сосущий ротовой аппарат полужесткокрылых насекомых прокалывает растительную ткань для питания и выделения слюны, одновременно эффективно передавая вирус2. Описаны различные механизмы передачи вирусов растений насекомыми-переносчиками. К ним относятся нестойкие, полуперсистирующие и персистирующие. Персистирующий тип является либо неразмножающимся, либо размножающимся3,4, но для обоих этих типов передаваемый вирус должен перемещаться по всему телу насекомого. При персистирующе-размножении вирусы сначала заражают и размножаются в эпителиальных клетках кишечника насекомого, затем распространяются в различные ткани и, в конечном итоге, в слюнные железы, откуда затем могут быть введены в растение через слюну во время кормления насекомого 5,6. Персистирующие передаваемые вирусы перемещаются через разные органы и размножаются в своих насекомых-переносчиках, что требует специфических взаимодействий между компонентами вируса и вектора на разных стадиях 7,8.
Вирусные белки и белки насекомых должны взаимодействовать, чтобы облегчить критические процессы распознавания, заражения, репликации или распространения вирусов у насекомых-переносчиков 9,10. Хотя оптическая микроскопия может быть использована для наблюдения клеточных структур у насекомых, она не может показать распределение вирионов, клеточную локализацию или колокализацию вирусных белков и белка насекомых или ультраструктуру тканей и клеток насекомых. Иммунофлюоресцентное мечение было впервые выполнено Coons et al. в фагоцитарных клетках мыши посредством мечения специфических флуоресцеиновых антител, а теперь оно широко используется11. Метод иммунофлуоресценции, также известный как метод флуоресцентных антител, является одним из самых ранних разработанных методов иммунологической маркировки и основан на специфической реакции связывания между антигеном и антителом11,12. Известное антитело сначала мечают флуоресцеином, который используется в качестве зонда для обнаружения соответствующих антигенов в клетках или тканях13,14. После того, как меченное флуоресцеином антитело связывается с соответствующим антигеном в клетках или тканях, зонд будет излучать яркую флуоресценцию при облучении длинами волн возбуждения и просмотре с помощью флуоресцентного микроскопа для локализации антигена15.
Большинство насекомых-переносчиков вирусов растений являются полужесткокрылыми. Более высокая плотность популяции насекомых-переносчиков, обладающих высокой эффективностью передачи вируса растений, может привести к вирусным эпидемиям5. Южный вирус черного карликового риса (SRBSDV, род Fijivirus, семейство Reoviridae), один из самых серьезных патогенов риса, быстро распространился по районам выращивания риса в Восточной и Юго-Восточной Азии и вызвал серьезные потери урожая с 2010 года16,17. Взрослые особи и нимфы белоспинного кузнечика (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) передают SRBSDV рису стойким способом размножения с высокой эффективностью. Полевые исследования показали, что вспышки SRBSDV-индуцированной болезни карликов риса с черными полосами обычно совпадают с массовой миграцией WBPH на большие расстояния, что является решающим фактором эпидемий SRBSDV 7,8,18. Везикул-ассоциированный мембранный белок 7 (VAMP7) представляет собой растворимый рецептор белка прикрепления N-этилмалеимида, чувствительного к фактору присоединения (SNARE), который может опосредовать транспорт веществ посредством слияния везикул. VAMP7 взаимодействует с внешним основным капсидным белком SRBSDV in vitro, что указывает на то, что VAMP7 может быть тесно связан с передачей вируса16.
В протоколе, представленном здесь, мы исключили кишечник из вирулиферного WBPH в качестве примера для маркировки вирионов SRBSDV и VAMP7 в эпителиальных клетках средней кишки16. Эпителий средней кишки, как начальное место инвазии вируса, играет жизненно важную роль в заражении, репликации и передаче вируса. Во-первых, мы подробно описали шаги по удалению кишечника у нимф и взрослых особей WBPH. Во-вторых, мы использовали специфические антитела, меченные флуоресцеином, для маркировки вирионов SRBSDV и VAMP7 в эпителиальных клетках кишечника. Затем мы наблюдали эпителиальные клетки и клеточное расположение вирионов и VAMP7 с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Результаты показали, что вирионы SRBSDV и VAMP7 могут колокализоваться в цитоплазме эпителиальных клеток средней кишки, предполагая, что специфическая функция VAMP7 может быть связана с распространением вирионов из эпителиальных клеток средней кишки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для достижения наилучших результатов следует учитывать несколько ключевых моментов. Во-первых, необходимо высокое соотношение вирулентных насекомых от общей численности населения. Несмотря на то, что минимальный AAP для SRBSDV нимфами и взрослыми особями WBPH составляет 5 мин17,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (31630058 по X.W. и 31772134 по W.L.).
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. . Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Kruse, A., et al. Combining’omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
