Marquage immunofluorescent de protéines de virus végétaux et d’insectes vecteurs dans les intestins d’hémiptères

Summary

Ce protocole de marquage immunofluorescent des protéines virales végétales et des protéines d’insectes vecteurs dans les intestins d’insectes excisés peut être utilisé pour étudier les interactions entre les insectes virus et vecteurs, les fonctions des protéines d’insectes et les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transmission du virus.

Abstract

La plupart des virus végétaux dans la nature sont transmis d’une plante à l’autre par des insectes hémiptères. Une forte densité de population d’insectes vecteurs qui sont très efficaces pour la transmission du virus joue un rôle clé dans les épidémies de virus dans les champs. L’étude des interactions virus-insecte vecteur peut faire progresser notre compréhension de la transmission virale et des épidémies dans le but de concevoir de nouvelles stratégies pour contrôler les virus végétaux et leurs insectes vecteurs. Le marquage par immunofluorescence a été largement utilisé pour analyser les interactions entre les agents pathogènes et les hôtes et est utilisé ici chez la cicadelle à dos blanc (WBPH, Sogatella furcifera), qui transmet efficacement le virus nain strié noir du riz du sud (SRBSDV, genre Fijivirus, famille Reoviridae), pour localiser les virions et les protéines d’insectes dans les cellules épithéliales de l’intestin moyen. À l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, nous avons étudié les caractéristiques morphologiques des cellules épithéliales de l’intestin moyen, la localisation cellulaire des protéines d’insectes et la colocalisation de virions et d’une protéine d’insecte. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les activités virales chez les insectes, les fonctions des protéines d’insectes et les interactions entre le virus et l’insecte vecteur.

Introduction

La plupart des virus végétaux décrits sont transmis par des insectes de l’ordre des hémiptères qui comprend les pucerons, les aleurodes, les cicadelles, les cicadelles et les thrips ^1,2. Les pièces buccales perçantes-suceuses des insectes hémiptères percent le tissu végétal pour nourrir et sécréter de la salive, transmettant simultanément efficacement le virus². Différents mécanismes de transmission des virus végétaux par les insectes vecteurs ont été décrits. Ceux-ci incluent non persistant, semi-persistant et persistant. Le type persistant est soit non multiplicatif, soit^{multiplicateur 3,4}, mais pour ces deux types^, le virus transmis doit se déplacer dans tout le corps de l’insecte. En mode de propagation persistante, les virus infectent et se répliquent d’abord dans les cellules épithéliales de l’intestin de l’insecte, puis se disséminent dans différents tissus, et éventuellement dans les glandes salivaires, d’où ils peuvent ensuite être introduits dans une plante par la salive lors de l’alimentation des insectes ^5,6. Les virus transmis de manière persistante se déplacent à travers différents organes et se répliquent dans leurs insectes vecteurs, ce qui nécessite des interactions spécifiques entre les composants du virus et du vecteur à différents stades ^7,8.

Les protéines virales et les protéines d’insectes doivent interagir pour faciliter les processus critiques de reconnaissance, d’infection, de réplication ou de dissémination du virus^chez les insectes vecteurs ^9,10. Bien que la microscopie optique puisse être utilisée pour observer les structures cellulaires chez les insectes, elle ne peut pas montrer la distribution du virion, la localisation cellulaire ou la colocalisation des protéines virales et des protéines d’insectes, ou l’ultrastructure des tissus et des cellules des insectes. Le marquage par immunofluorescence a d’abord été effectué par Coons et al. dans les cellules phagocytaires de la souris au moyen du marquage d’anticorps spécifiques à la fluorescéine, et maintenant il est largement utilisé¹¹. La technique d’immunofluorescence, également connue sous le nom de technique des anticorps de fluorescence, est l’une des premières techniques de marquage immunologique développées et est basée sur la réaction de liaison spécifique entre l’antigène et l’anticorps^11,12. L’anticorps connu est d’abord marqué avec de la fluorescéine, qui est utilisée comme sonde pour détecter les antigènes correspondants dans les cellules ou les tissus^13,14. Une fois que l’anticorps marqué à la fluorescéine s’est lié à l’antigène correspondant dans les cellules ou les tissus, la sonde émettra une fluorescence brillante lorsqu’elle est irradiée avec des longueurs d’onde d’excitation et vue avec un microscope à fluorescence pour localiser l’antigène¹⁵.

La plupart des insectes vecteurs des virus végétaux sont des hémiptères. Une densité de population plus élevée d’insectes vecteurs ayant une efficacité de transmission élevée du virus végétal peut entraîner des épidémies^{virales 5}. Le virus du nain strié noir du riz méridional (SRBSDV, genre Fijivirus, famille Reoviridae), l’un des agents pathogènes les plus graves du riz, s’est rapidement propagé dans les zones rizicoles d’Asie de l’Est et du Sud-Est et a causé de graves pertes de rendement depuis 2010^16,17. Les adultes et les nymphes de la cicadelle à dos blanc (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) transmettent le SRBSDV au riz de manière persistante et multiplicatrice avec une grande efficacité. Des études sur le terrain ont montré que les éclosions de naines noires du riz induites par le SRBSDV coïncident généralement avec la migration massive sur de longues distances des globules du riz occidental, un facteur crucial dans les épidémies de SRBSDV 7,8,18. La protéine membranaire associée aux vésicules 7 (VAMP7) est un récepteur soluble de la protéine de fixation du facteur sensible au N-éthylmaléimide (SNARE), qui peut servir de médiateur dans le transport de substances par fusion de vésicules. VAMP7 interagit avec la protéine de capside majeure externe du SRBSDV in vitro, ce qui indique que VAMP7 pourrait être étroitement associé à la transmission du virus¹⁶.

Dans le protocole présenté ici, nous avons excisé l’intestin de l’HPBT virulifère à titre d’exemple pour marquer les virions SRBSDV et VAMP7 dans les cellules épithéliales de l’intestin moyen¹⁶. En tant que site d’invasion initial du virus, l’épithélium de l’intestin moyen joue un rôle essentiel dans l’infection, la réplication et la transmission du virus. Tout d’abord, nous avons détaillé les étapes pour exciser l’intestin des nymphes et des adultes de WBPH. Deuxièmement, nous avons utilisé des anticorps spécifiques marqués à la fluorescéine pour marquer les virions SRBSDV et VAMP7 dans les cellules épithéliales intestinales. Ensuite, nous avons observé les cellules épithéliales et l’emplacement cellulaire des virions et VAMP7 via un microscope confocal à balayage laser. Les résultats ont montré que les virions SRBSDV et VAMP7 pouvaient colocaliser dans le cytoplasme des cellules épithéliales de l’intestin moyen, suggérant que la fonction spécifique de VAMP7 pourrait être liée à la dissémination des virions des cellules épithéliales de l’intestin moyen.

Protocol

1. Élevage d’insectes non virulifères Collecter les WBPH dans les rizières et les élever avec des plants de riz dans des béchers en verre de 1 L recouverts d’un filet anti-insectes dans un incubateur à 28 °C avec 16 h de lumière et 8 h d’obscurité. Comme le SRBSDV n’est pas transmis par les œufs, les nymphes nouvellement écloses ne sont pas virulifères. À l’aide d’un stylo-brosse, brosser doucement les insectes du bécher dans un nouveau bécher de plants de riz frais chaque s…

Representative Results

La figure 1 illustre toutes les étapes de ce protocole : élevage d’insectes, acquisition de virus, excision de l’intestin, marquage immunofluorescent et fabrication de la lame. Les intestins de WBPH excisés des adultes ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4% (m / v), perméabilisés avec 2% (v / v) Triton X-100, puis incubés avec Dylight 633 phalloïdine10,18. La micrographie confocale à …

Discussion

Pour de meilleurs résultats, quelques points clés doivent être pris en compte. Tout d’abord, un ratio élevé d’insectes virulifères par rapport à la population totale est nécessaire. Bien que le PAA minimum pour le SRBSDV par les nymphes et les adultes de WBPH soit de 5 min¹⁷, les insectes devraient être autorisés à se nourrir de plants de riz frais infectés par le SRBSDV pendant 2 jours pour atteindre une efficacité d’acquisition allant jusqu’à 80%. Étant donné que les viri…

Materials

3% Bull serum albumin (BSA)	Coolaber	SL1331	Dilute antibodies
Cover glass	Solarbio	YA0771-18*18mm	For slide making
Dissecting microscope	Beitja	XTL-7045B1	For insect dissection
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	Zeiss LSM880	Observe fluorescence signal
Microscope slides	Solarbio	ZBP-7105	For slide making
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cell necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For tissues fixation
Phalloidin	Invitrogen	A22284	Label actin of midgut epithiels
Triton X-100	Amresco	0290C484	For tissues permeation
Tweezers (5-SA)	AsOne	6-7905-40	For insect dissection