وضع العلامات المناعية للفيروسات النباتية وبروتينات ناقلات الحشرات في الأمعاء النصفية
Summary
يمكن استخدام هذا البروتوكول الخاص بوضع العلامات المناعية لكل من بروتينات الفيروسات النباتية وبروتينات الحشرات الناقلة في أمعاء الحشرات المستأصلة لدراسة التفاعلات بين الحشرات الفيروسية والحشرات الناقلة ، ووظائف بروتين الحشرات والآليات الجزيئية الكامنة وراء انتقال الفيروس.
Abstract
تنتقل معظم فيروسات النباتات في الطبيعة من نبات إلى آخر عن طريق الحشرات النصفية. تلعب الكثافة السكانية العالية للحشرات الناقلة ذات الكفاءة العالية في انتقال الفيروس دورا رئيسيا في أوبئة الفيروسات في الحقول. يمكن لدراسة التفاعلات بين الفيروسات والحشرات أن تعزز فهمنا لانتقال الفيروس والأوبئة بهدف تصميم استراتيجيات جديدة للسيطرة على فيروسات النباتات وحشراتها الناقلة لها. تم استخدام وضع العلامات المناعية على نطاق واسع لتحليل التفاعلات بين مسببات الأمراض والمضيفين ويستخدم هنا في نطاط النبات الأبيض الظهر (WBPH ، Sogatella furcifera) ، الذي ينقل بكفاءة فيروس القزم الأسود المخطط للأرز الجنوبي (SRBSDV ، جنس Fijivirus ، عائلة Reoviridae) ، لتحديد موقع الفيروسات وبروتينات الحشرات في الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى. باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر ، درسنا الخصائص المورفولوجية للخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى ، والتوطين الخلوي لبروتينات الحشرات ، والتمركز المشترك للفيروسات وبروتين الحشرات. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة أنشطة الفيروس في الحشرات ، ووظائف بروتينات الحشرات ، والتفاعلات بين الفيروس والحشرة الناقلة.
Introduction
تنتقل معظم فيروسات النباتات الموصوفة عن طريق الحشرات من رتبة Hemiptera التي تشمل حشرات المن ، والذباب الأبيض ، ونطاطات الأوراق ، ونطاطات النبات ، والتريبس1،2. تخترق أجزاء الفم الماصة للحشرات النصفية الأنسجة النباتية لتغذية وإفراز اللعاب ، وفي نفس الوقت تنقل الفيروسبكفاءة 2. تم وصف آليات انتقال مختلفة للفيروسات النباتية بواسطة الحشرات الناقلة للأمراض. وتشمل هذه غير الثابتة وشبه الثابتة والمستمرة. النوع الثابت إما غير تكاثري أو تكاثري 3,4 ، ولكن بالنسبة لكلا النوعين ، يجب أن يتحرك الفيروس المنقول في جميع أنحاء جسم الحشرة. في وضع التكاثر المستمر ، تصيب الفيروسات في البداية وتتكاثر في الخلايا الظهارية لأمعاء الحشرة ، ثم تنتشر في أنسجة مختلفة ، وفي النهاية إلى الغدد اللعابية ، حيث يمكن بعد ذلك إدخالها في النبات من خلال اللعاب أثناء تغذية الحشرات 5,6. تنتقل الفيروسات المنقولة باستمرار عبر أعضاء مختلفة وتتكاثر في نواقل الحشرات ، الأمر الذي يتطلب تفاعلات محددة بين الفيروس ومكونات الناقل في مراحل مختلفة 7,8.
يجب أن تتفاعل البروتينات الفيروسية وبروتينات الحشرات لتسهيل العمليات الحرجة للتعرف على الفيروسات أو العدوى أو التكاثر أو الانتشار في الحشرات الناقلة 9,10. على الرغم من أنه يمكن استخدام الفحص المجهري الضوئي لمراقبة الهياكل الخلوية في الحشرات ، إلا أنه لا يمكن أن يظهر توزيع virion أو التوطين الخلوي أو التمركز المشترك للبروتينات الفيروسية وبروتين الحشرات أو البنية التحتية لأنسجة وخلايا الحشرات. تم إجراء وضع العلامات المناعية لأول مرة بواسطة Coons et al. في الخلايا البلعمية للفأر عن طريق تسمية أجسام مضادة فلوريسئين محددة ، والآن يتم استخدامه على نطاق واسع11. تعد تقنية التألق المناعي ، والمعروفة أيضا باسم تقنية الأجسام المضادة الفلورية ، واحدة من أقدم تقنيات وضع العلامات المناعية التي تم تطويرها وتستند إلى تفاعل الربط المحدد بين المستضد والجسم المضاد11,12. يتم تمييز الجسم المضاد المعروف أولا بالفلوريسئين ، والذي يستخدم كمسبار للكشف عن المستضدات المقابلة في الخلايا أو الأنسجة13,14. بعد أن يرتبط الجسم المضاد المسمى بالفلوريسئين بالمستضد المقابل في الخلايا أو الأنسجة ، سيصدر المسبار مضانا ساطعا عند تشعيعه بأطوال موجية للإثارة وعرضه باستخدام مجهر مضان لتحديد موقع المستضد15.
معظم الحشرات الناقلة للفيروسات النباتية هي hemipterans. يمكن أن تؤدي الكثافة السكانية العالية للحشرات الناقلة التي تتمتع بكفاءة انتقال عالية لفيروس النبات إلى أوبئة الفيروس5. انتشر فيروس قزم الأرز الجنوبي الأسود (SRBSDV ، جنس Fijivirus ، عائلة Reoviridae) ، أحد أخطر مسببات الأمراض للأرز ، بسرعة في جميع أنحاء مناطق زراعة الأرز في شرق وجنوب شرق آسيا ، وتسبب في خسائر فادحة في الغلة منذ عام 201016,17. ينقل البالغون والحوريات من نطاط النبات الأبيض الظهر (WBPH ، Sogatella furcifera Horváth) SRBSDV إلى الأرز بطريقة إكثارية مستمرة بكفاءة عالية. أظهرت الدراسات الميدانية أن تفشي مرض القزم الأسود المستحث ب SRBSDV يتزامن عادة مع الهجرة الجماعية لمسافات طويلة من WBPHs ، وهو عامل حاسم في أوبئة SRBSDV7،8،18. البروتين الغشائي المرتبط بالحويصلة 7 (VAMP7) هو مستقبل بروتين ارتباط عامل حساس للذوبان N-ethylmaleimide (SNARE) ، والذي يمكنه التوسط في نقل المواد عبر اندماج الحويصلة. يتفاعل VAMP7 مع بروتين القفيصة الرئيسي الخارجي ل SRBSDV في المختبر ، مما يشير إلى أن VAMP7 قد يكون مرتبطا ارتباطا وثيقا بانتقال الفيروس16.
في البروتوكول المقدم هنا ، قمنا باستئصال القناة الهضمية من WBPH الخبيث كمثال لتسمية فيروسات SRBSDV و VAMP7 في الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى16. كموقع غزو أولي للفيروس ، تلعب ظهارة الأمعاء الوسطى أدوارا حيوية في الإصابة بالفيروس وتكاثره وانتقاله. أولا ، قمنا بتفصيل خطوات استئصال القناة الهضمية من الحوريات والبالغين من WBPHs. ثانيا ، استخدمنا أجساما مضادة محددة تحمل علامة الفلوريسئين لتسمية فيروسات SRBSDV و VAMP7 في الخلايا الظهارية المعوية. ثم لاحظنا الخلايا الظهارية والموقع الخلوي للفيروسات و VAMP7 عبر مجهر المسح بالليزر. أظهرت النتائج أن فيروسات SRBSDV و VAMP7 يمكن أن تتمركز في سيتوبلازم الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى ، مما يشير إلى أن الوظيفة المحددة ل VAMP7 قد تكون مرتبطة بنشر الفيروسات من الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى.
Protocol
Representative Results
Discussion
للحصول على أفضل النتائج ، ينبغي النظر في بعض النقاط الرئيسية. أولا ، من الضروري وجود نسبة عالية من الحشرات الخبيثة بين إجمالي السكان. على الرغم من أن الحد الأدنى من AAP ل SRBSDV بواسطة حوريات WBPH والبالغين هو 5 دقائق17 ، يجب السماح للحشرات بالتغذي على نباتات الأرز الطازجة المصابة ب SRBS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31630058 إلى X.W. و 31772134 إلى WL).
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. . Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Kruse, A., et al. Combining’omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
