Immunfluorescerende merking av plantevirus og insektvektorproteiner i hemipteran tarm

Summary

Denne protokollen for immunfluorescerende merking av både plantevirusproteiner og vektorinsektproteiner i utskåret insekttarm kan brukes til å studere interaksjoner mellom virus- og vektorinsekter, insektproteinfunksjoner og molekylære mekanismer som ligger til grunn for virusoverføring.

Abstract

De fleste plantevirus i naturen overføres fra en plante til en annen av hemipteran insekter. En høy befolkningstetthet av vektorinsekter som er svært effektive ved virusoverføring, spiller en nøkkelrolle i virusepidemier i felt. Studier av virus-insektvektorinteraksjoner kan fremme vår forståelse av virusoverføring og epidemier med sikte på å designe nye strategier for å kontrollere plantevirus og deres vektorinsekter. Immunfluorescensmerking har blitt mye brukt til å analysere interaksjoner mellom patogener og verter og brukes her i hvitrygget plantehopper (WBPH, Sogatella furcifera), som effektivt overfører det sørlige risstripete dvergviruset (SRBSDV, slekt Fijivirus, familie Reoviridae), for å lokalisere virionene og insektproteinene i midttarmepitelcellene. Ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi studerte vi de morfologiske egenskapene til midttarmepitelceller, cellulær lokalisering av insektproteiner og samlokalisering av virioner og et insektprotein. Denne protokollen kan brukes til å studere virusaktiviteter hos insekter, funksjoner av insektproteiner og interaksjoner mellom virus og vektorinsekt.

Introduction

De fleste beskrevne plantevirus overføres av insekter fra ordenen Hemiptera som inkluderer bladlus, hvitefugler, bladhoppere, plantehoppere og trips ^1,2. De piercing-sugende munndelene av hemipteraninsekter gjennomsyrer plantevevet for fôring og utskillelse av spytt, samtidig som viruset overføres effektivt². Ulike overføringsmekanismer av plantevirus av vektorinsekter er beskrevet. Disse inkluderer ikke-vedvarende, semipersistent og vedvarende. Den vedvarende typen er enten ikke-propagativ eller propagativ^3,4, men for begge disse typene må det overførte viruset bevege seg gjennom hele insektets kropp. I vedvarende-propagativ modus infiserer virus først og replikerer i epitelceller i insektets tarm, forplanter seg deretter i forskjellige vev, og til slutt inn i spyttkjertlene, hvorfra de deretter kan innføres i en plante gjennom spytt under insektfôring ^5,6. Vedvarende overførte virus beveger seg gjennom forskjellige organer og replikerer i insektvektorene, noe som krever spesifikke interaksjoner mellom virus- og vektorkomponenter i forskjellige stadier ^7,8.

Virale proteiner og insektproteiner må samhandle for å lette kritiske prosesser for virusgjenkjenning, infeksjon, replikasjon eller spredning i vektorinsekter ^9,10. Selv om optisk mikroskopi kan brukes til å observere cellulære strukturer i insekter, kan den ikke vise virionfordeling, cellulær lokalisering eller kolokalisering av virale proteiner og insektprotein, eller ultrastruktur av insektvev og celler. Immunfluorescensmerking ble først utført av Coons et al. i fagocytiske celler i musen ved å merke spesifikke fluoresceinantistoffer, og nå brukes den mye¹¹. Immunfluorescensteknikken, også kjent som fluorescensantistoffteknikken, er en av de tidligste immunologiske merkingsteknikkene som er utviklet og er basert på den spesifikke bindingsreaksjonen mellom antigenet og antistoffet^11,12. Det kjente antistoffet er først merket med fluorescein, som brukes som en sonde for å oppdage de tilsvarende antigenene i cellene eller vevene^13,14. Etter at det fluoresceinmerkede antistoffet binder seg til det tilsvarende antigenet i celler eller vev, vil sonden avgi lys fluorescens når den bestråles med eksitasjonsbølgelengder og ses med et fluorescensmikroskop for å lokalisere antigenet¹⁵.

De fleste vektorinsekter av plantevirus er hemipteraner. En høyere befolkningstetthet av vektorinsekter som har høy overføringseffektivitet for planteviruset kan føre til virusepidemier⁵. Sørlig ris svart stripete dvergvirus (SRBSDV, slekt Fijivirus, familie Reoviridae), en av de mest alvorlige patogener av ris, har raskt spredt seg gjennom risvoksende områder i Øst- og Sørøst-Asia, og forårsaket alvorlige avkastningstap siden 2010^16,17. Voksne og nymfer av hvitrygget plantehopper (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) overfører SRBSDV til ris på en vedvarende propagativ måte med høy effektivitet. Feltstudier har vist at utbrudd av SRBSDV-indusert ris svart stripete dvergsykdom vanligvis sammenfaller med masse langdistansemigrasjon av WBPHs, en avgjørende faktor i SRBSDV-epidemier ^7,8,18. Vesikkelassosiert membranprotein 7 (VAMP7) er en løselig N-etylmaleimidsensitiv faktorfesteproteinreseptor (SNARE), som kan formidle transport av stoffer via vesikkelfusjon. VAMP7 interagerer med det ytre store kapsidproteinet til SRBSDV in vitro, noe som indikerer at VAMP7 kan være nært forbundet med virusoverføring¹⁶.

I protokollen som presenteres her, fjernet vi tarmen fra viruliferous WBPH som et eksempel for å merke SRBSDV-virioner og VAMP7 i midttarmepitelceller¹⁶. Som det første invasjonsstedet for virus, spiller midttarmepitelet viktige roller i virusinfeksjon, replikasjon og overføring. Først detaljerte vi trinnene for å skille tarmen fra nymfer og voksne av WBPHs. For det andre brukte vi spesifikke fluoresceinmerkede antistoffer for å merke SRBSDV-virioner og VAMP7 i tarmepitelceller. Deretter observerte vi epitelceller og den cellulære plasseringen av virionene og VAMP7 via et laserskanning konfokalmikroskop. Resultatene viste at SRBSDV-virioner og VAMP7 kunne samlokaliseres i cytoplasmaet til midttarmepitelcellene, noe som tyder på at den spesifikke funksjonen til VAMP7 kan være relatert til spredning av virioner fra midttarmepitelceller.

Protocol

1. Ikke-viruliferous insektoppdrett Samle WBPHs fra rismarker og bak med risplanter i 1 L glassbeger dekket med insektsikkert nett i en inkubator ved 28 ° C med 16 t lys og 8 h mørk. Fordi SRBSDV ikke overføres via egg, er nyklekte nymfer ikke viruliferous. Med en penselpenn børster du forsiktig insekter fra begeroppdrettsinsektene i et nytt beger med ferske risplanter hver uke til WBPH-nymfene har klekket. Fortsett oppdrett disse klekkede nonviruliferous nymfer til 2- eller 3-instar.NOTAT: B?…

Representative Results

Figur 1 illustrerer alle trinnene i denne protokollen: insektoppdrett, virusoppkjøp, eksisjon av tarmen, immunfluorescerende merking og fremstilling av lysbildet. Utskåret WBPH-tarm fra voksne ble fiksert i 4% (m / v) paraformaldehyd, permeabilisert med 2% (v / v) Triton X-100, og deretter inkubert med Dylight 633 phalloidin10,18. Laserskanningens konfokalmikrograf i figur 2…

Discussion

For best resultat, bør noen viktige punkter vurderes. For det første er et høyt forhold av viruliferous insekter blant den totale befolkningen nødvendig. Selv om minimum AAP for SRBSDV av WBPH-nymfer og voksne er 5 min¹⁷, bør insektene få lov til å mate på friske SRBSDV-infiserte risplanter i 2 d for å oppnå en oppkjøpseffektivitet på opptil 80%. Siden SRBSDV-virionene kan påvises i 80% av midguts¹⁸, fjernet og merket vi viruliferous insekter ved 2 d etter en 2…

Materials

3% Bull serum albumin (BSA)	Coolaber	SL1331	Dilute antibodies
Cover glass	Solarbio	YA0771-18*18mm	For slide making
Dissecting microscope	Beitja	XTL-7045B1	For insect dissection
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	Zeiss LSM880	Observe fluorescence signal
Microscope slides	Solarbio	ZBP-7105	For slide making
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cell necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For tissues fixation
Phalloidin	Invitrogen	A22284	Label actin of midgut epithiels
Triton X-100	Amresco	0290C484	For tissues permeation
Tweezers (5-SA)	AsOne	6-7905-40	For insect dissection