Immunofluorescerande märkning av växtvirus och insektsvektorproteiner i hemipterantarmar
Summary
Detta protokoll för immunofluorescerande märkning av både växtvirusproteiner och vektorinsektsproteiner i utskurna insektstrån kan användas för att studera interaktioner mellan virus- och vektorinsekter, insektsproteinfunktioner och molekylära mekanismer bakom virusöverföring.
Abstract
De flesta växtvirus i naturen överförs från en växt till en annan av hemipteran insekter. En hög populationstäthet av vektorinsekter som är mycket effektiva vid virusöverföring spelar en nyckelroll i virusepidemier på fält. Att studera virus-insektsvektorinteraktioner kan öka vår förståelse av virusöverföring och epidemier i syfte att utforma nya strategier för att kontrollera växtvirus och deras vektorinsekter. Immunofluorescensmärkning har använts i stor utsträckning för att analysera interaktioner mellan patogener och värdar och används här i den vitryggiga växthopparen (WBPH, Sogatella furcifera), som effektivt överför södra risets svarta streckade dvärgvirus (SRBSDV, släktet Fijivirus, familjen Reoviridae), för att lokalisera virionerna och insektsproteinerna i midgutepitelcellerna. Med hjälp av laserskanningskonfokalmikroskopi studerade vi de morfologiska egenskaperna hos midgutepitelceller, cellulär lokalisering av insektsproteiner och samlokalisering av virioner och ett insektsprotein. Detta protokoll kan användas för att studera virusaktiviteter hos insekter, funktioner hos insektsproteiner och interaktioner mellan virus och vektorinsekter.
Introduction
De mest beskrivna växtvirusen överförs av insekter från ordningen Hemiptera som inkluderar bladlöss, vitflugor, bladhoppare, växthoppare och thrips 1,2. De piercing-sugande munstyckena av hemipteraninsekter genomborrar växtvävnaden för att mata och utsöndra saliv, samtidigt som viruset överförs effektivt2. Olika överföringsmekanismer av växtvirus av vektorinsekter har beskrivits. Dessa inkluderar icke-beständiga, semipersistent och persistenta. Den långlivade typen är antingen icke-förökningsbar eller förökningsmedel3,4, men för båda dessa typer måste det överförda viruset röra sig genom insektens kropp. I persistent-propagative mode infekterar och replikerar virus initialt i epitelcellerna i insektens tarm, sprider sig sedan till olika vävnader och så småningom in i spottkörtlarna, varifrån de sedan kan införas i en växt genom saliven under insektsmatning 5,6. Långlivade överförda virus rör sig genom olika organ och replikeras i sina insektsvektorer, vilket kräver specifika interaktioner mellan virus och vektorkomponenter i olika stadier 7,8.
Virala proteiner och insektsproteiner måste interagera för att underlätta kritiska processer för virusigenkänning, infektion, replikation eller spridning i vektorinsekterna 9,10. Även om optisk mikroskopi kan användas för att observera cellulära strukturer hos insekter, kan den inte visa virionfördelning, cellulär lokalisering eller samlokalisering av virala proteiner och insektsprotein eller ultrastrukturen hos insektsvävnader och celler. Immunofluorescensmärkning utfördes först av Coons et al. i musens fagocytiska celler genom märkning av specifika fluoresceinantikroppar, och nu används den i stor utsträckning11. Immunofluorescenstekniken, även känd som fluorescensantikroppstekniken, är en av de tidigaste immunologiska märkningsteknikerna som utvecklats och baseras på den specifika bindningsreaktionen mellan antigenet och antikroppen11,12. Den kända antikroppen märks först med fluorescein, som används som en sond för att detektera motsvarande antigener i cellerna eller vävnaderna13,14. Efter att den fluoresceinmärkta antikroppen binder till motsvarande antigen i celler eller vävnader kommer sonden att avge ljus fluorescens när den bestrålas med excitationsvåglängder och ses med ett fluorescensmikroskop för att lokalisera antigenet15.
De flesta vektorinsekter av växtvirus är hemipteraner. En högre befolkningstäthet av vektorinsekter som har en hög överföringseffektivitet för växtviruset kan leda till virusepidemier5. Sydligt risstrimmigt dvärgvirus (SRBSDV, släktet Fijivirus, familjen Reoviridae), en av de allvarligaste patogenerna för ris, har snabbt spridit sig över risodlingsområden i Öst- och Sydostasien och orsakat allvarliga avkastningsförluster sedan 201016,17. Vuxna och nymfer av den vitryggade växthopparen (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) överför SRBSDV till ris på ett ihållande förökningssätt med hög effektivitet. Fältstudier har visat att utbrott av SRBSDV-inducerad rissvartstrimmig dvärgsjukdom vanligtvis sammanfaller med massmigration av WBPH, en avgörande faktor i SRBSDV-epidemier 7,8,18. Vesikelassocierat membranprotein 7 (VAMP7) är en löslig N-etylmaleimidkänslig faktorbindningsproteinreceptor (SNARE), som kan förmedla transport av ämnen via vesikelfusion. VAMP7 interagerar med det yttre huvudkapsidproteinet i SRBSDV in vitro, vilket indikerar att VAMP7 kan vara nära associerat med virusöverföring16.
I protokollet som presenteras här skar vi ut tarmen från viruliferös WBPH som ett exempel för att märka SRBSDV-virioner och VAMP7 i midgutepitelceller16. Som den första invasionsplatsen för virus spelar midgutepitelet viktiga roller vid virusinfektion, replikering och överföring. Först detaljerade vi stegen för att skära tarmen från nymfer och vuxna av WBPH. För det andra använde vi specifika fluoresceinmärkta antikroppar för att märka SRBSDV-virioner och VAMP7 i tarmepitelceller. Sedan observerade vi epitelceller och den cellulära placeringen av virionerna och VAMP7 via ett laserskanningskonfokalmikroskop. Resultaten visade att SRBSDV-virioner och VAMP7 kunde samlokaliseras i cytoplasman i midgutepitelcellerna, vilket tyder på att VAMP7: s specifika funktion kan vara relaterad till spridning av virioner från midgutepitelceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
För bästa resultat bör några viktiga punkter beaktas. För det första är ett högt förhållande av viruliferösa insekter bland den totala befolkningen nödvändig. Även om den lägsta AAP för SRBSDV av WBPH-nymfer och vuxna är 5 min17, bör insekterna tillåtas att mata på färska SRBSDV-infekterade risplantor i 2 d för att uppnå en förvärvseffektivitet på upp till 80%. Eftersom SRBSDV-virionerna kan detekteras i 80% av midguts18, skar vi ut och märkte de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (31630058 till X.W. och 31772134 till W.L.).
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. . Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Kruse, A., et al. Combining’omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
