Immunofluorescente etikettering van plantenvirussen en insectenvectoreiwitten in hemipterandarmen
Summary
Dit protocol voor immunofluorescente etikettering van zowel plantaardige viruseiwitten als vectorinsecteneiwitten in weggesneden insectendarmen kan worden gebruikt om interacties tussen virus- en vectorinsecten, insecteneiwitfuncties en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan virusoverdracht te bestuderen.
Abstract
De meeste plantenvirussen in de natuur worden van de ene plant op de andere overgedragen door hemipteran insecten. Een hoge bevolkingsdichtheid van de vectorinsecten die zeer efficiënt zijn in virusoverdracht speelt een sleutelrol bij virusepidemieën in velden. Het bestuderen van virus-insect vectorinteracties kan ons begrip van virusoverdracht en epidemieën verbeteren met als doel nieuwe strategieën te ontwerpen om plantenvirussen en hun vectorinsecten te beheersen. Immunofluorescentie-etikettering is op grote schaal gebruikt om interacties tussen pathogenen en gastheren te analyseren en wordt hier gebruikt in de white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), die efficiënt het zuidelijke rijstzwart gestreepte dwergvirus (SRBSDV, genus Fijivirus, familie Reoviridae) overbrengt, om de virionen en insecteneiwitten in de midgutepitheelcellen te lokaliseren. Met behulp van laserscanning confocale microscopie bestudeerden we de morfologische kenmerken van midgut-epitheelcellen, cellulaire lokalisatie van insecteneiwitten en de colocalisatie van virionen en een insecteneiwit. Dit protocol kan worden gebruikt om virusactiviteiten bij insecten, functies van insecteneiwitten en interacties tussen virus en vectorinsect te bestuderen.
Introduction
De meeste beschreven plantenvirussen worden overgedragen door insecten uit de orde Hemiptera die bladluizen, witte vliegen, leafhoppers, planthoppers en tripsomvat 1,2. De piercing-zuigende monddelen van hemipteran-insecten doorboren het plantenweefsel voor het voeden en afscheiden van speeksel, waardoor het virus tegelijkertijd efficiënt wordt overgedragen2. Verschillende overdrachtsmechanismen van plantenvirussen door vectorinsecten zijn beschreven. Deze omvatten niet-persistent, semipersistent en persistent. Het persistente type is niet-propagatief of voortplantingsf3,4, maar voor beide typen moet het overgedragen virus door het lichaam van het insect bewegen. In de persistent-propagatieve modus infecteren en repliceren virussen aanvankelijk in de epitheelcellen van de darm van het insect, verspreiden zich vervolgens in verschillende weefsels en uiteindelijk in de speekselklieren, van waaruit ze vervolgens via het speeksel in een plant kunnen worden geïntroduceerd tijdens insectenvoeding 5,6. Persistente overgedragen virussen bewegen zich door verschillende organen en repliceren in hun insectenvectoren, wat specifieke interacties tussen virus- en vectorcomponenten in verschillende stadia vereist 7,8.
Virale eiwitten en insecteneiwitten moeten interageren om kritieke processen voor virusherkenning, infectie, replicatie of verspreiding in de vectorinsectente vergemakkelijken 9,10. Hoewel optische microscopie kan worden gebruikt om cellulaire structuren bij insecten te observeren, kan het geen virionverdeling, cellulaire lokalisatie of colocalisatie van virale eiwitten en insecteneiwitten, of de ultrastructuur van insectenweefsels en -cellen laten zien. Immunofluorescentie-etikettering werd voor het eerst uitgevoerd door Coons et al. in de fagocytische cellen van de muis door middel van het labelen van specifieke fluoresceïne-antilichamen, en nu wordt het op grote schaal gebruikt11. De immunofluorescentietechniek, ook bekend als de fluorescentie-antilichaamtechniek, is een van de vroegste immunologische etiketteringstechnieken die is ontwikkeld en is gebaseerd op de specifieke bindingsreactie tussen het antigeen en het antilichaam11,12. Het bekende antilichaam wordt eerst gelabeld met fluoresceïne, dat wordt gebruikt als een sonde om de overeenkomstige antigenen in de cellen of weefsels te detecteren13,14. Nadat het fluoresceïne-gelabelde antilichaam zich bindt aan het overeenkomstige antigeen in cellen of weefsels, zal de sonde heldere fluorescentie uitzenden wanneer bestraald met excitatiegolflengten en bekeken met een fluorescentiemicroscoop om het antigeen15 te lokaliseren.
De meeste vectorinsecten van plantenvirussen zijn hemipterans. Een hogere populatiedichtheid van vectorinsecten met een hoge transmissie-efficiëntie voor het plantenvirus kan leiden tot virusepidemieën5. Zuidelijk rijstzwart gestreept dwergvirus (SRBSDV, geslacht Fijivirus, familie Reoviridae), een van de ernstigste ziekteverwekkers van rijst, heeft zich snel verspreid over rijstteeltgebieden in Oost- en Zuidoost-Azië en veroorzaakte ernstige opbrengstverliezen sinds 201016,17. Volwassenen en nimfen van de witrugplanthopper (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) brengen SRBSDV op rijst over op een persistent-vermeerderingsve manier met een hoge efficiëntie. Veldstudies hebben aangetoond dat uitbraken van SRBSDV-geïnduceerde rijstzwart gestreepte dwergziekte meestal samenvallen met massale langeafstandsmigratie van WBPHs, een cruciale factor in SRBSDV-epidemieën 7,8,18. Vesicle-associated membrane protein 7 (VAMP7) is een oplosbare N-ethylmaleimide-gevoelige factor attachment protein receptor (SNARE), die het transport van stoffen via vesikelfusie kan bemiddelen. VAMP7 interageert in vitro met het buitenste belangrijke capsid-eiwit van SRBSDV, wat aangeeft dat VAMP7 nauw geassocieerd kan zijn met virusoverdracht16.
In het hier gepresenteerde protocol hebben we de darm uit virulifere WBPH weggesneden als voorbeeld om SRBSDV-virionen en VAMP7 in midgut-epitheelcellen te labelen16. Als de eerste invasieplaats van het virus speelt het midgut-epitheel een vitale rol bij virusinfectie, replicatie en overdracht. Eerst hebben we de stappen beschreven om de darm te verwijderen van nimfen en volwassenen van WBPHs. Ten tweede gebruikten we specifieke fluoresceïne-gelabelde antilichamen om SRBSDV-virionen en VAMP7 in darmepitheelcellen te labelen. Vervolgens observeerden we epitheelcellen en de cellulaire locatie van de virionen en VAMP7 via een laserscannende confocale microscoop. De resultaten toonden aan dat SRBSDV-virionen en VAMP7 konden colokaliseren in het cytoplasma van de midgutepitheelcellen, wat suggereert dat de specifieke functie van VAMP7 gerelateerd kan zijn aan de verspreiding van virionen uit midgutepitheelcellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor de beste resultaten moeten een paar belangrijke punten worden overwogen. Ten eerste is een hoge verhouding van virulifere insecten onder de totale populatie noodzakelijk. Hoewel de minimale AAP voor SRBSDV door WBPH-nimfen en volwassenen 5 min17 is, moeten de insecten zich gedurende 2 d kunnen voeden met verse SRBSDV-geïnfecteerde rijstplanten om een acquisitie-efficiëntie van maximaal 80% te bereiken. Omdat de SRBSDV-virionen in 80% van de midguts18 kunnen worden ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (31630058 aan X.W. en 31772134 aan W.L.).
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. . Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Kruse, A., et al. Combining’omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
